Микроскопия проходящего света

ОПТИЧЕСКАЯ МИКРОСКОПИЯ

Современные оптические микроскопы делятся на 2 класса по методу формирования изображения – классические (проходящего света) и конфокальные, на 2 типа по взаимному расположению препарата и объектива – прямые и инвертированные, а также по уровню сложности – обучающие, лабораторные и исследовательские.

Микроскопия проходящего света

Микроскоп проходящего света это сложная оптико-механическая конструкция, имеющая осветительную, воспроизводящую и визуализирующую системы.

Осветительная часть микроскопа состоит из источника света, создающего световой поток; коллектора и конденсора. Задачей осветительной части является создание светового потока, который должен пройти через препарат и не нарушить его оптических свойств (поглощение, отражение, цветопередачу) и геометрических параметров (контура, размеров).

Воспроизводящая часть - объектив, который создает увеличенное изображение препарата с максимальной достоверностью по форме, цвету и разрешению элементов.

Визуализирующая часть микроскопа может состоять: из окуляра (оптического элемента проектирующего изображение препарата), системы «окуляр — оптовар» (оптовар — система дополнительного увеличения, расположенная между объективом и окуляром), адаптера (дополнительный элемент, для соединения фото-видеокамеры с микроскопом и системы «оптовар — адаптер».

Предел разрешения светового микроскопа зависит от длины световой волны, которая для видимого света лежит в диапазоне 0,38 (фиолетовый цвет) — 0,76 мкм (красный). Отсюда следует, что самыми мелкими объектами, которые можно наблюдать в световой микроскоп, являются бактерии и митохондрии (0,5 мкм). Повышение точности обработки линз не может преодолеть это ограничение, которое задано волновой природой света.

Очень важная характеристика микроскопа — предельное разрешение, позволяющее наблюдать два объекта в отдельности. Оно зависит от волновой природы света и апертуры использованной системы линз. Теоретически возможный предел составляет 0,2 мкм (при длине волны 0,4 мкм и апертуре 1,4). Это значит, что два объекта, если они разделены расстоянием менее 0,2 мкм, будут выглядеть, как одно целое.

Существующие модели классических микроскопов проходящего света (плоского поля) можно комплектовать в зависимости от методов исследования. У естествоиспытателя есть выбор между прямым или инвертированным микроскопом. Отличаются они друг от друга расположением и рабочим расстоянием объектива до объекта исследования. В прямых микроскопах объектив располагается сверху предметного столика, а рабочее расстояние составляет от 0,1 мм до 20 мм в зависимости от увеличения объектива, у инвертированных – снизу предметного столика, и с большим рабочим расстоянием от 30 до 70 мм.

Рис.1. Современный исследовательский биологический микроскоп (фирмы Leica). Основные характеристики: галогеновый осветитель100Вт, моторизованный револьвер на 8 объективов, моторизованный конденсор, моторизованный столик, моторизованная наводка на резкость, встроенный активный ж/к экран для управления микроскопом. Может быть использован: для работы методом светлого поля, темного поля, фазового контраста, интерференционного контраста и флуоресценции.

На большинстве микроскопов последнего поколения (исследовательские) можно реализовать следующие методы исследования в зависимости от комплектации:

1. Светлое поле – используется для изучения окрашенных и высококонтрастных препаратов. В поле зрения на светлом фоне наблюдают контрастное однотонное или естественное цветное изображение объекта.

2. Тёмное поле и фазовый контраст – для изучения неокрашенных нативных препаратов. Изучение препаратов в темном поле осуществляется с помощью особого темнопольного конденсора. Такой конденсор пропускает от источника света только косые краевые лучи, которые освещают препарат, но не попадают в объектив. Клетки и их компоненты обладают различной оптической плотностью и по-разному рассеивают попадающие на них лучи. Рассеяние лучей вызывает свечение внутриклеточных структур. Чем плотнее структура, тем ярче она видна на темном фоне. Фазовый контраст осуществляется с помощью фазово-контрастного устройства, в состав которого входят: специальный конденсор и фазовые объективы. Метод фазового контраста основан на том, что отдельные участки прозрачного препарата отличаются от окружающей среды по показателю преломления. Свет проходит через внутриклеточные структуры с разной скоростью, что приводит к смещению фаз и изменению яркости отдельных участков.

3. Дифференциальный интерференционный контраст – для чёткой визуализации границ между объектами, различающимися по толщине и/или коэффициенту преломления. В таком микроскопе пучок параллельных световых лучей от осветителя разделяется на две ветви – верхнюю и нижнюю. Нижняя ветвь проходит через препарат, и фаза ее светового колебания изменяется, а верхняя ветвь минует препарат и остается неизменной. В призмах объектива эти ветви соединяются и интерферируют. Интерференция представляет собой результат сложения двух волн с одинаковыми периодами, но со смещенными фазами. В результате участки препарата, обладающие разной толщиной или разными показателями преломления, окрашиваются в различные цвета, становятся контрастными и хорошо видимыми. Следовательно, интерференционная микроскопия позволяет судить о толщине структур и о содержании сухого вещества в клетке.

4. Поляризационный контраст–для выявления объектов, поворачивающих плоскость поляризации. Поляризационный микроскоп является модификацией светового микроскопа, в котором установлены два поляризационных фильтра — первый (поляризатор) между пучком света, и объектом, а второй (анализатор) между линзой объектива и глазом. Через первый фильтр свет проходит только в одном направлении, второй фильтр имеет главную ось, которая располагается перпендикулярно первому фильтру, и он не пропускает свет. Получается эффект темного поля. Оба фильтра могут вращаться, изменяя направление пучка света. Если анализатор повернуть на 90° по отношению к поляризатору, то свет проходить через них не будет. Структуры, содержащие продольно ориентированные молекулы (коллаген, микротрубочки, микрофиламенты), и кристаллические структуры (в клетках Лейдига) при изменении оси вращения проявляются как светящиеся. Способность кристаллов или паракристаллических образований к раздвоению световой волны на обыкновенную и перпендикулярную к ней называется двойным лучепреломлением. Такой способностью обладают фибриллы поперечнополосатых мышц.

5. Флуоресценция - для получения изображения в микроскопе используется свет определенной длинны волны от ртутно-кварцевых или ксеноновых ламп, который вызывает флюоресценцию (люминесценцию) объекта. Отдельные молекулы вещества, поглощая фотоны света, переходят в возбужденное состояние и при переходе к исходному (нормальному) состоянию испускают кванты света, большей длинны волны на 20 – 50 нм (закон Стокса). Различают первичную и вторичную флуоресценцию. Первичная присуща ряду биологически активных веществ, таких, как ароматические аминокислоты, порфирины, хлорофилл, витамины А, В₂, В₁ , некоторые антибиотики (тетрациклин) и химиотерапевтические вещества (акрихин, риванол). Вторичная возникает в результате обработки микроскопируемых объектов флюоресцирующими красителями – флюорохромами. Некоторые из этих красителей диффузно распределяются в клетках, другие избирательно связываются с определёнными структурами клеток или даже с определёнными химическими веществами. Люминесцентный микроскоп снабжен мощным источником освещения с большой поверхностной яркостью, максимум излучения которого находится в коротковолновой области видимого спектра, системой светофильтров, а также интерференционной светоделительной пластинкой, применяемой при возбуждении люминесценции падающим светом. Для возбуждения флюоресценции при люминесцентной микроскопии обычно используют длинноволновую ультрафиолетовую (область спектра 0,25 – 0,4 мкм), сине-фиолетовую, а иногда и зелёную область спектра. В люминесцентном микроскопе применяют обычно стеклянную оптику и обычные предметные и покровные стёкла, пропускающие излучение в этой части спектра и не обладающие собственной люминесценцией.

Развитие микроскопических методов исследования и цифровых технологий способствовало появлению новых моделей микроскопов.