6 страница

Для диагностики воздействия загрязнений на морфологические характеристики применяются методы оценки флуктуирующей асим­метрии.

Симметрия как вид согласованности отдельных частей живых организмов имеет общебиологическое значение. При работе с био­логическими объектами в настоящее время используется класси­фикация асимметрий (нарушений симметрии) по Л. Ван Валену, согласно которой они подразделяются на три типа:

1) направленная асимметрия, когда какая-то структура раз­вита на одной стороне больше, чем на другой (например, сердце млекопита­ющих);

2) антиасимметрия – большее развитие структуры на од­ной из сторон (правша и левша в популяции человека);

3) флуктуирующая асимметрия – незначительные ненаправленные от­клонения от строгой билатеральной симметрии.

Флуктуирующая асимметрия является результатом неспособ­ности организмов развиваться по точно определенному плану. Раз­личия между сторонами не являются генетически детерминиро­ванными и не имеют адаптивного значения. Выступая в качестве меры стабильности развития, флуктуирующая асимметрия харак­теризует состояние морфогенетического гомеостаза – способно­сти организма к формированию генетически детерминированно­го фенотипа при минимальном уровне онтогенетических наруше­ний. Таким образом, флуктуирующая асимметрия может быть оха­рактеризована как одно из наиболее обычных и доступных для анализа проявлений случайной изменчивости развития.

Рядом научных исследований показано, что вели­чина асимметрии реагирует на различные химические и физические факторы и может являться мерой нарушения развития орга­низма. Флуктуирующая асимметрия – это один из общих показателей, характеризующий стабильность индиви­дуального развития, дающий оценку состояния природных попу­ляций и зависящий от состояния среды. Величина флуктуирую­щей асимметрии и ее зависимость от определенных факторов мо­жет быть определена лишь на популяционном уровне.

Примером морфологического подхода в биотестировании является использование высшей водной растительности (ряски малой, элодеи канадской и др.) для оценки степени хронического токсического действия вод. Критерием токсичности воды является отклонение в скорости роста и внешнем виде (форма листьев, цвет поверхности листовых пластинок, наличие заболеваний) по сравнению с контролем.

Другим примером является оценка эмбриотоксичности природных и сточных вод, пищевых добавок, фармакологических препаратов, которая основывается на изучении аномалий развития амфибий. Эмбрионы и молодь гидробионтов являются уникальным объектом для исследования механизмов повреждений, вызванных токсичными агентами. Морфологические нарушения быстро визуализируются, что позволяет отследить ход их развития и получить сведения о характере повреждений [4].

Физиологический подход.Одна из наиболее важных характеристик, высокочувствитель­ная к стрессовому воздействию среды, – энергетика физиологи­ческих процессов. Наиболее экономичный энергетический обмен имеет место лишь при строго определенных условиях среды, ко­торые могут быть охарактеризованы как оптимальные.

Для характеристики энергетического обмена две величины яв­ляются фундаментальными: основной обмен и максимальный об­мен. Основной обмен отражает минимальный уровень потребле­ния энергии, необходимый для обеспечения нормального функционирования организма при отсутствии каких-либо внешних воздействий. Максимальный обмен соответствует предельному количеству энергии, которое организм способен выработать в слу­чае необходимости. Разность между этими величинами представ­ляет энергетический ресурс адаптации конкретного вида живот­ных, поскольку основной и максимальный уровни обмена явля­ются видоспецифическими величинами.

Интенсив­ность энергетического обмена аэробного организма может быть определена посредством измерения скорости потребления кис­лорода. При оптимальных условиях организм находится на самом низком энергетическом уровне, при любых негативных измене­ниях среды обитания потребность в кислороде будет увеличи­ваться.

Другая базовая характеристика, перспективная для оценки стрессовых воздействий, – темп и ритмика ростовых процессов.

Важной характеристикой физиологических процессов являет­ся поведенческая активность живых организмов. Например, тест с использованием инфузории спиростомы основан на оценке изменения скорости ее движения под воздействием химических раздражителей. Аналогичным образом изучение поведения дафний позволяет оценивать степень загрязнения воды: с увеличением концентрации токсикантов у дафний повышается активность, изменяется окраска и внешний вид органов, животные перестают питаться и в конечном счете погибают при значительных концентрациях токсикантов.

В качестве тест-функций применяются физиологические пара­метры пресноводных беспозвоночных гидробионтов разных уровней филогенеза.

Свойства внешней среды, и в частности гидросферы, прояв­ляются в интенсивности воздействия на организм или популяцию отдельных факторов или их комбинаций. Вещества, поступающие в водоем антропогенным путем, могут оказывать регулирующее, трофическое, токсическое и информативное воздействие на гидробионты. При незначительных концентрациях в водоеме эти ве­щества можно выявить, оценивая физиологический статус гомеостатических показателей организма, которые могут изменяться при сдвигах в окружающей среде.

Наибольший интерес представляют типы поведения, относя­щиеся к эволюционно-универсальным реакциям, свойственным всем эукариотам, включая человека. К таким феноменам относят­ся: спонтанная двигательная активность как врожденная форма поведения и память – приобретенная форма поведения.

Целостное поведение животных рассматривается как лабиль­ное взаимодействие врожденных и приобретенных элементарных реакций, необходимое для быстрой и эффективной адаптации к условиям среды. Изучение поведения сложно и требует тщатель­ных наблюдений в природе, подкрепленных лабораторными эк­спериментами. Таким образом, поведение является эволюционно обуслов­ленным показателем физиологического состояния животного. На основании изменений в поведенческих феноменах одного вида животных можно прогнозировать нарушения поведения и других видов. Выбор форм поведения для биотестирования определяет­ся их чувствительностью к изменениям, происходящим в окру­жающей среде.

Биофизический подход.Биофизические методы контроля качества среды всегда осно­ваны на инструментальном определении нарушений биохимиче­ских и биофизических процессов тест-организмов. Наиболее широкое распространение получили флуориметрические и люминесцентные методы измерений, обладающие высокой чув­ствительностью.

Измеряя интенсивность флуоресценции хлорофилла можно оценить состояние фотосинтетической активности водорослей, помещенных в среду, содержащую токсиканты.

При использовании специальных люминесцирующих культур организмов (биосенсоров) и приборов люминометров возможно проведение в течение нескольких минут исследования токсичности веществ или сред даже в полевых условиях. Свечение биосенсоров в тестируемой среде обратно пропорционально концентрации токсиканта.

Помимо сказанного, применение люминесцентных и флуориметрических методов позволяет проводить количественные измерения в режиме реального времени и автоматизировать процесс измерения. Люминесцентные и флуориметрические ме­тоды в ряде случаев дают возможность не только экспрессно те­стировать качество среды, но и проводить детальный анализ состояния фитопланктонного сообщества, а также про­гнозировать его развитие.

Иммунологический подход.В дополнение к генетическому подходу, характеризующему эффективность иммунной системы организма в отношении элиминации клеток с генетическими нарушениями, возможны развернутая оценка изменений иммунореактивности животного, исследование параметров иммунитета, таких как состав крови и гемолимфы, определение наличия антител в жидкостях организ­ма, концентрации белков плазмы, перивисцеральной жидкости, оценка динамики клеточного состава.

Основная функция иммунной системы состоит в поддержании постоянства внутренней среды организма. Иммунная система – одна из самых лабильных, поэтому любые серьезные изменения в сре­де обитания влияют на функциональную активность иммунокомпетентных клеток:

1) фагоцитов – клеток, обеспечивающих захват и переваривание чужерод­ных или измененных собственных клеточных структур;

2) Т-лимфоцитов, регулирующих взаимодействие клеток внутри системы; они осуществляют распознавание и унич­тожение генетически чужеродных и измененных клеток организ­ма, дают сигнал В-лимфоцитам к синтезу антител;

3) В-лимфоцитов, продуцирующих антитела иммуноглобулиновой приро­ды, которые нейтрализуют действие чужеродных агентов и облег­чают фагоцитоз.

Иммунологический подход при оценке состояния окружаю­щей среды заключается в изучении изменений врожденного и при­обретенного иммунитета у беспозвоночных и позвоночных живот­ных.

Параметры иммунитета животных как критерий состояния организмов, их популяций и сообществ экосистем при техногенном воздействии сравниваются с нормой (при отсутствии воздействия).

При появлении в среде чужеродных агентов у тест-организмов резко возрастает концентрация антимикробных белков (миелопероксидаза, лактоферрин, эластаза, катепсин G, лизоцим, дефенсины), катионных полипептидов, фагоцитов и гемацитов. Определение на­личия специфических антител и сравнение этих параметров с нормой позволяют сделать выводы об изменении условий среды обитания или появлении заболеваний у животных.

Тестирование позволяет определять состоя­ние живых организмов по комплексу морфологических, генети­ческих, физиологических, биохимических, биофизических и иммунологических параметров. Используемый набор методов иссле­дования и тестов охватывает разные стороны индивидуального раз­вития организма, обеспечивая интегральную оценку состояния биоты и качества среды в целом.

На практике наиболее распространенными методами биотестирования являются те, в которых фиксируются, главным образом, такие интегральные параметры, как показатели выживаемости, роста, плодовитости тест-организмов.

Все рассмотренные группы методов биотестирования характеризуются своими особенностями. Это и доступность тест-объекта, которая определяется возможностью его культивирования в лабораторных условиях, поддержанием необходимых условий температуры, освещенности, сложностью состава питательных сред, чистотой воздуха и пр. Это и оперативность получения ответа. Наиболее быстрые реакции на токсическое воздействие равных концентраций удается регистрировать у простых организмов – бактерий, водорослей и инфузорий. Наступление таких реакций ограничивается минутами или несколькими часами. Сутками измеряется проявление ответных реакций более крупных объектов (у ракообразных – дафний, артемий), а так называемая хроническая токсичность оценивается в течение многих суток и даже недель. Каждый метод характеризуется и своими техническими способами реализации.

С точки зрения технического оснащения наиболее доступными оказываются методы, основанные на регистрации общебиологических характеристик: подсчете численности или прироста (гибели) популяций, который можно осуществить с использованием микроскопа или увеличительного стекла практически в любой лаборатории. Для проведения физиолого-биохимических оценок и определения соотношения, например, живых и мертвых клеток или флуоресценции тест-культур организмов необходима специальная аппаратура [4, 39].

Общим правилом для всех методов является оценка надежности тест-культур. Известно, что живые организмы по разным причинам со временем могут менять свою чувствительность, поэтому обязательной процедурой в лаборатории является контроль тест-объекта с помощью модельного токсиканта. Например, для определения пригодности культуры дафний для биотестирования проводится процедура определения диапазона реагирования тест-организмов на модельный токсикант. Методом последовательных разбавлений готовится серия растворов двухромовокислого калия K₂Cr₂O₇ в культивационной воде с концентрациями 0,5; 0,9; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 мг/дм³. В приготовленные растворы помещаются дафнии. По истечении времени экспозиции проводится подсчет численности погибших рачков. Если концентрация растворов, вызвавших острую токсичность (гибель рачков более 50%), находится в диапазоне 0,9–2,0 мг/дм³, то чувствительность культуры дафний соответствует необходимым требованиям, и она может быть использована в биотестировании [43]. Аналогичным образом проводится оценка чувствительности для водорослей, инфузорий, рыб и пр. [7, 19, 26, 27].

Методы биотестирования просты, относительно недороги, пригодны для широкого применения и дают возможность оцени­вать качество природной среды при всем многообразии экологи­ческих изменений.

7.3. Применение биотестирования в природоохранной деятельности

Биологические методы, как правило, обладают высокой чувствительностью, улавливают более низкие концентрации веществ, чем аналитические датчики, к тому же, как уже отмечалось, по информативности для последствий вредного воздействия на окружающую природную среду превосходят физико-химические методы анализа. В связи с этим использование методов биотестирования является обязательным элементом природоохранной деятельности [4, 39].

Метод биотестирования наряду с физико-химическими методами применяется при установлении нормативных требований к качеству вод, проведении экологического контроля за соблюдением нормативов допустимых сбросов химических веществ в водные объекты, нормативов допустимых воздействий хозяйственной и иной деятельности на водные объекты, осуществлении государственного экологического мониторинга за состоянием водных объектов в районах расположения источников антропогенного воздействия, проведении оценки изменения состояния водных экосистем, биоценозов.

Исследования в области разработки и использования методов биотестирования в водоохранной практике проводились во многих научно-исследовательских и учебных институтах. В 1980 г. была признана необходимость применения биотестирования как показателя оперативной интегральной диагностики качества вод. В 1981–1986 гг. методики биотестирования были апробированы и рекомендованы для определения токсичности сточных и природных вод. По итогам апробации Всесоюзным научно-исследовательским институтом по охране вод (ВНИИВО) – головным институтом по разработке и использованию методов определения токсичности вод – в 1990 г. было подготовлено и утверждено Государственным комитетом СССР по охране природы «Методическое руководство по биотестированию воды» (РД 118-02-90). В этот документ вошли методики с использованием тест-объектов – представителей основных трофических звеньев водной экосистемы: водорослей, ракообразных и рыб.

Принятые Госкомприроды СССР в 1991 г. «Правила охраны поверхностных вод» по сути обязывали контролировать токсичность как сточных вод (при этом сточные воды не должны оказывать острого токсического воздействия на тест-объекты), так и поверхностных вод в контрольном створе, где вода не должна оказывать хронического токсического действия. Позднее для целей государственного экологического контроля Минприроды России, а затем Госкомэкологией России были подготовлены и утверждены методики для определения токсичности воды с использованием в качестве тест-объектов инфузорий и ракообразных (ПНД Ф Т* 14.1:2:3:4.2-98; ПНД Ф Т 14.1:2:3:4.3-99; ПНД Ф Т 14.1:2:3:4.4-99) и для определения токсичности вод, почв и донных отложений – методика биотестирования по ферментативной активности бактерий (ПНД Ф Т 14.1:2:3:4.1-96, 16.2:2:3:1.2-96) [27].

С тех пор количество методик выполнения измерений, внесенных в государственный реестр и рекомендованных для целей практического экологического контроля окружающей среды, увеличилось ненамного и охватывает достаточно ограниченный перечень тест-организмов (табл. 7.1).

Таблица 7.1. Методики, рекомендованные для целей практического экологического контроля окружающей среды

Окончание табл. 7.2

Широкий спектр тест-объектов и большой набор методик представлен в утвержденном Минприроды и Минсельхоз России в 2001 г. Временном методическом руководстве, направленном на установление нормативов допустимого содержания химических веществ, в частности нефти, в донных отложениях поверхностных водных объектов. Документ содержит набор методик по определению максимально допустимых уровней веществ, аккумулированных донными отложениями, на основе модельных экспериментальных исследований с использованием чувствительных биологических тест-объектов. И, что особенно важно, в список тест-объектов включены экологически соответствующие организмы – организмы-редуценты (бактерии), организмы-продуценты (водоросли и макрофиты), зоопланктон (инфузории и ракообразные), зообентос (моллюски и хирономиды) и рыбы (эмбрионы и взрослые особи) [7].

В последние годы Росгидрометом наработана методическая база мониторинга токсического загрязнения водных объектов с помощью биотестирования на основе принципов организации и проведения режимных наблюдений и оперативных работ в системе мониторинга поверхностных вод суши. Утвержден ряд нормативных документов, включающих методики оценки токсичности как водных вытяжек, так и неизмененных донных отложений с использованием экологически соответствующих тест-объектов [28–31].

Огромное значение методы биотестирования имеют в разработке ПДК загрязняющих веществ водных объектов рыбохозяйственного назначения. Большинство из величин ПДК для таких водных объектов установлены экспериментально с использованием «Методических рекомендаций по установлению предельно допустимых концентраций загрязняющих веществ для воды рыбохозяйственных водоемов» (М.: ВНИРО, 1986), «Методических указаний по установлению эколого-рыбохозяйственных нормативов (ПДК и ОБУВ) загрязняющих веществ для водных объектов, имеющих рыбохозяйственное значение» (М.: ВНИРО, 1998). В состав методов, рекомендуемых данными документами, для обоснования ПДК вошли физиологические, биофизические, морфологические и генетические методы с использованием гидробионтов различных классификационных групп: организмы-редуценты, организмы-продуценты, зоопланктон, зообентос) и рыбы [19].

Важным нормативным актом, регламентирующим обязательное применение биологических тест-систем для выявления экологической токсичности промышленных отходов, являются «Критерии отнесения опасных отходов к классу опасности для окружающей природной среды», утвержденные Приказом Министерства природных ресурсов России в 2001 г. Впервые процедура выявления класса опасности отходов для окружающей природной среды основывается не только на количественных расчетах по химическому составу содержащихся компонентов, но и на экспериментальной биологической проверке образцов [24] .

Согласно принятому документу, экспериментальный метод используется в следующих случаях:

для подтверждения отнесения отходов к пятому классу опасности, установленному расчетным методом;

при отнесении к классу опасности отходов, у которых невозможно определить их качественный и количественный состав;

при уточнении по желанию и за счет заинтересованной стороны класса опасности отходов, полученного в соответствии с расчетным методом.

Суть биотестирования отходов сводится к получению водной вытяжки из отхода в соотношении отход : вода – 1 : 10, приготовлению из полученной вытяжки серии разбавлений, в которые и помещаются тест-объекты. По величине смертности тест-объекта (при использовании водорослей возможен также и прирост их биомассы в случае перехода в вытяжку питательных веществ – биогенов, микроэлементов) определяют кратность разбавления, которая не оказывает острое токсическое воздействие на тест-объект. Класс опасности отхода оценивается в соответствии с критериями отнесения опасных отходов к классу опасности для окружающей природной среды. Градация классов опасности приведена в табл. 7.2 [24, табл. 4].

Таблица 7.2. Градация классов опасности отходов по степени воздействия водной вытяжки на тест-объекты

При определении класса опасности отхода для ОПС с помощью метода биотестирования водной вытяжки применяется не менее двух тест-объектов из разных систематических групп (дафнии и инфузории, цериодафнии и бактерии или водоросли и т. п.). За окончательный результат принимается класс опасности, выявленный на тест-объекте, проявившем более высокую чувствительность к анализируемому отходу [24].

Перечень наиболее широко распространенных в России биотестов, применяемых в биотестировании отходов, включает методы с использованием ряда эвритопных видов: зеленых водорослей – сценедесмус (Scenedesmus quadricauda Turp. Breb.) и хлорелла (Chlorella vulgaris Beijer); ракообразных – дафний (Daphnia magna Straus) и цериодафний (Ceriodaphnia affinis Lilljeborg); простейших – инфузорий (Paramecium caudatum Erenberg) и некоторых других (см. табл. 7.1). На том основании, что наибольшую опасность для объектов окружающей среды представляет водно-миграционный путь распространения токсичных компонентов отходов, тест-организмы представляют собой виды гидробионтов. Вместе с тем совершенно очевидно, что загрязнение разных типов почв отходами сопровождается как процессами связывания токсикантов и их аккумуляцией, так и биологическим переносом и транслокацией, поэтому для анализа почвенных образцов, загрязненных отходами, целесообразно применять более широкий спектр тест-организмов, включающий почвообитающие организмы, или педобионты [39].

Среди возможностей применения методов биотестирования в природоохранной деятельности следует отметить их пригодность в мониторинге районов с интен­сивным развитием промышленности и сельского хозяйства. Кро­ме того, биотестирование позволяет провести беглое сканирова­ние больших пространств в целях ранней диагностики экологи­ческих нарушений. В данном случае достаточно ограничиться наи­более простыми, но эффективными методами, основанными, на­пример, на морфологических или физиологических показателях.

Обобщить результаты, полученные методами биотестирования, допустимо по всем методам в пределах каждого подхода; по всем подходам для каждого вида или группы видов живых организмов; для экосистемы в целом, что дает надежную суммарную оценку состояния среды и исключает ошибочное заключение, вполне возможное при использовании единичных показателей в отноше­нии отдельных видов. Итоговое заключение должно содержать ха­рактеристику качества среды в исследуемом районе (оценку сте­пени отклонения от нормы и фонового состояния, оконтуривание зоны ощутимых последствий воздействия) и оценку благо­приятности среды для человека.

Комплексная оценка качества среды обитания помимо исполь­зования разных подходов и тест-объектов биотестирования подразумевает организацию наблюдений за всеми природными сре­дами, в первую очередь за воздушной, водной и почвенной ком­понентами биосферы [4].

Таким образом, можно выделить направления использования методов биотестирования:

оценка токсичности водной среды (сточные воды, природные воды – с целью выявления потенциальных источников загрязнения; питьевые воды);

контроль эффективности работы очистных сооружений сточных вод;

контроль эффективности водоподготовки питьевых вод;

экспериментальная оценка токсичности промышленных отходов с целью установления их класса опасности;

проведение экологической и санитарно-эпидемиологической экспертиз новых материалов, веществ, технологий очистки и пр.

мониторинг воды и донных отложений водных объектов;

мониторинг почв;

мониторинг атмосферного воздуха.

ГЛАВА 8. СПЕЦИФИКА И МЕХАНИЗМ
ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ

8.1. Химический канцерогеногенез

Канцерогеном(физическим, химическим и вирусным) называют агент, способный вызывать или ускорять развитие новообразования независимо от механизма (или механизмов) его действия или от степени специфичности эффекта. Канцероген– это агент, который в силу своих физических или химических свойств может вызывать необратимое изменение или повреждение в тех частях генетического аппарата, которые осуществляют гомеостатический контроль над соматическими клетками. Канцерогенность отражает способность того или иного фактора вызывать опухоли.

Канцерогенная опасность (риск) – вероятность значительного повышения частоты возникновения опухолей у людей, подвергающихся воздействию определенных канцерогенных факторов в быту и/или на производстве, коррелирующая с индивидуальными особенностями образа жизни, эндогенными факторами (факторами организма), загрязнениями окружающей среды или профессиональными вредностями.

Классификации канцерогенов.Химические канцерогены в зависимости от их происхождения могут быть разделены на две группы: природные, то есть не связанные с деятельностью человека, и антропогенные, появление которых в окружающей среде обусловлено деятельностью человека. Однако подобная градация носит условный характер, поскольку практически все канцерогены природного происхождения могут поступать в окружающую среду и извне в результате антропогенной или техногенной деятельности (например, поверхностно-активные углеводороды).

Столь же условно разделение канцерогенов на химические, физические и биологические агенты (например, асбест или кремний может рассматриваться и как химическое соединение, и как физический агент).

Существует классификация химических канцерогенов в зависимости от характера их действия на организм:

вещества местного действия, вызывающие опухоли на месте аппликации, например бенз(а)пирен;