Растворы гемоглобина

Гемоглобин является белком эритроцитов и обеспечивает транспорт кислорода и углекислого газа в живых организмах. По своей структуре молекула гемоглобина состоит из двух молекул альфа‑протеина и двух молекул бета‑протеина. Внутри эритроцита гемоглобин образует разные виды кристаллических упаковок, сами по себе эти упаковки очень хрупкие и вне эритроцита мгновенно разваливаются от небольших перепадов температуры пли колебаний рН‑среды, образуя субъединицы, оказывающие повреждающее действие на почечную ткань, приводящие к тромбообразованию. В 60‑е годы физиологи попробовали стабилизировать гемоглобин перекрестным связыванием альфа‑ и бета‑субъединиц и соединением отдельных молекул гемоглобина с получением гемоглобинового полимера. Многократно ученые брались за создание газотранспортного гемоглобинового кровезаменителя, но положительных результатов так и не получили. По словам старшего научного сотрудника Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН Сергея Воробьева: «Причин тому несколько. Сами по себе молекулы гемоглобина нельзя запустить в кровяное русло. Гемоглобин мгновенно будет связан белками плазмы, например, альбумином и будет утилизирован в почках, костном мозге и селезенке. Этот процесс может привести к гемоглобинурии (лихорадка, головные боли, боли в мышцах и суставах) и, хуже того, вызвать тромбоз сосудов».

Учитывая, что свободный гемоглобин в крови распадается на субъединицы, появилась идея поместить его в микрокапсулу. Над проблемой получения капсулы для гемоглобина ученые всего мира работают уже более 30 лет. Они создавали оболочки гемоглобина из смеси фосфолипидов, холестерина, яичного лецитина. Однако эти искусственно созданные эритроциты выживали в кровеносном русле экспериментальных животных всего несколько часов. Возникает мгновенный иммунный ответ, проявляющийся сильной аллергической реакцией. Искусственные эритроциты разрушаются и выводятся из кровотока, не выполнив свою основную функцию, – транспорта газов. Существует еще одна проблема: экспериментальный эритроцит способен связывать кислород в легочной ткани, однако с трудом отдает его. Эта проблема побудила ученых‑физиологов отказаться от поиска создания микрокапсул и приступить к разработке гемоглобина, не распадающегося на субъединицы. Стойкость молекулы гемоглобина должна обеспечиваться химическими методами. Эти соединения получили названия полигемоглобиновых кристаллов, или полигемоглобиновых комплексов. Главное преимущество полигемоглобиновых кристаллов в том, что отсутствует иммунный ответ организма на их введение.

Для большей устойчивости полигемоглобиновой упаковки ее сшивают глутаровым альдегидом или диимидоэфирами. Это приводит к возникновению не только межмолекулярных, но и внутримолекулярных сшивок, что ограничивает подвижность частей молекулярной системы, а главное, сильно уменьшает способность транспортировать газы.

Компания Baxter в 1998 г. опубликовала материалы по созданию препарата под названием ГемАссист на основе связанного гемоглобина. Однако в итоге проведенного анализа результатов лечения 100 пострадавших от огнестрельных или колотых ранений и жертв автомобильных аварий выяснилось, что пациенты, которые применяли ГемАссист, умирали чаще, чем те, кто получал общепринятую терапию. В результате компания прекратила выпуск препарата.

Ученые провели сотни экспериментов на животных, были и клинические испытания препаратов для кислородной терапии. Однако управление по контролю за пищевыми продуктами и лекарствами США (FDA) не разрешило применение этих средств в медицинской практике. В работах доктора Абду Элайш из Центра биологических исследований FDA отмечено: «Доклинические и клинические испытания препаратов выявили общие для них побочные эффекты (имеется в виду повышение кровяного давления, нарушение работы желудочно‑кишечного тракта, панкреатит и поражения нервной системы). Поскольку в начале производства доклинические и клинические испытания на здоровых добровольцах проводились успешно, мало внимания было уделено механизму работы молекулы гемоглобина в новых условиях (то есть вне красных клеток крови), не говоря о влиянии химических и генетических манипуляций с молекулой гемоглобина». ГемАссист не выдержал клинических испытаний, что подтверждает точку зрения доктора Элайша о том, что вне клетки молекула гемоглобина может повести себя совершенно неожиданно. Однако это не остановило исследователей. Американские компании продолжают поиск новых гемоглобиновых средств, осуществляющих транспорт кислорода. Корпорация Baxter с 1990‑х гг. является лидером в разработках препаратов, сделанных на основе гемоглобина.

Калифорнийская компания Sangart Inc. из города Сан‑Диего выпустила универсальную искусственную кровь, которая могла бы подходить всем пациентам, независимо от их группы крови, под названием Гемоспан (Hemospan). Препарат на основе гемоглобина, обработанного полиэтиленгликолем. При добавлении полиэтиленгликоля образуется слой воды, который окружает белок. Этот водяной слой защищает белок от атаки иммунной системы, увеличивает эффективный размер молекулы гемоглобина и продлевает время его циркуляции. В Швеции в двух больницах Стокгольма – Южной и Каролинской – в конце 2003 г. компания Sangart начала вторую стадию клинических испытаний гемоспана. Препарат был назначен 8 больным. При подведении результатов профессор медицины Бенгта Фаргелля заявила, что испытания дали хорошие результаты. Преимущества препарата: совместимость с любой группой крови, малый риск заражения и длительный срок хранения. Недостаток: проводимость кислорода сокращается практически в два раза за первые двое суток. Следовательно, гемоспан может использоваться только в критических ситуациях.

В июне 2003 г. лаборатория Northfield Laboratories Inc.

(Эвангстон, Иллинойс) достигла соглашения с FDA на проведение третьей стадии клинических испытаний пиридоксилированного полимеризированного гемоглобина под названием ПолиГем. Препарат является единственным кровезаменителем, прошедшим все три стадии клинических испытаний. ПолиГем разрабатывался в Чикаго после Вьетнамской войны как военный проект. Препарат перспективен как в плане военного применения, так и гражданского. Производство ПолиГема состоит из нескольких этапов. Первый – извлечение и фильтрация гемоглобина из эритроцитов. Второй – многоступенчатая полимеризация, при которой очищенный гемоглобин связывается в тетрамеры. Третий – включение в раствор электролита. Процесс полимеризации гемоглобина является основным в производстве. Свободный гемоглобин связывает оксид азота, тем самым вызывает сужение сосудов; оседает в почках, вызывая нарушение почечной фильтрации.

Компания Hemosol Inc. (Миссиссуага, Онтарио, Канада) создала препарат полимерного гемоглобина под названием Гемолинк. Полимеризация гемоглобина была выполнена о‑ раффинозой. Препарат прошел все стадии клинических испытаний. При проведении анализа их результатов выяснилось, что у ряда пациентов наблюдались нежелательные побочные эффекты. В связи с этим в апреле 2003 г. производство гемолинка было прекращено. Четыре месяца спустя компания объявила, что препарат пройдет серию дополнительных исследований на экспериментальных животных.

Компания Baxter, лидер в производстве препаратов на основе гемоглобина, приобрела компанию Somatogem Inc., которая работала над молекулой рекомбинантного гемоглобина. Baxter активно включилась в работу по созданию препарата рекомбинантного гемоглобина бактериального происхождения, применив новую технологию с использованием рекомбинантной ДНК. Применение рекомбинантной ДНК весьма перспективно, так как позволяет отказаться от использования донорской крови. Однако 17 июля 2003 г. компания объявила о своем решении не продолжать испытаний, так как первые результаты оказались неудовлетворительными.

Современный лидер в торговле кислородными препаратами, корпорация Biopure, разработала препарат на основе бычьей крови под названием Оксиглобин. Препарат для ветеринарного применения (лечение анемии у собак), на основе полимезированного бычьего гемоглобина. Ветеринарный продукт Biopure's Oxyglobin(R) (hemoglobin glutamer – 200 (бычий)), или HB0C‑301, единственный кислородный терапевтический препарат, одобренный США.

Корпорация Biopure выпустила еще один препарат на основе гемоглобина животного происхождения, под названием Гемопьюр. Молекулы гемопьюра подверглись поперечной сшивке после предварительной очистки при помощи многократной фильтрации и хроматографии под высоким давлением. В технологии производства препарата использованы все новейшие достижения микробиологии, позволяющие полностью исключить риск заражения человека заболеваниями крупного рогатого скота (коровьим бешенством), ВИЧ‑инфекцией. Гемопьюр прошел 20 циклов успешных клинических испытаний в Америке и Европе. Южноафриканский Совет по медицинскому контролю первым в мире одобрил решение об использовании Hemopure(R) (hemoglobin glutamer – 250 (бычий)), или HB0C‑201 при лечении острой анемии, возникающей у пациентов хирургического профиля. Корпорация Biopure обратилась в FDA за разрешением продавать гемопьюр в США пациентам с острой анемией, перенесшим ортопедические операции. Гемопьюр обладает рядом преимуществ: совместим с любой группой крови, срок хранения – 2 года при комнатной температуре.

В течение трех лет исследователи из нескольких европейских государств планируют создать универсальный заменитель крови с помощью гриба Aspergillus niger и бактерии Escherichia coli. В проекте Euro Blood Substitutes участвуют 12 институтов. Координационный центр находится в Ноттингэмском университете. Цель нового проекта – сделать переливание безопасным. Применение донорской крови связано с высокими рисками, в частности, из‑за повсеместного распространения СПИДа. Гриб Aspergillus niger и бактерии Escherichia coli биоинженеры уже применяют для производства лекарств. С их помощью планируется синтезировать белки, аналогичные гемоглобину, которые будут способны осуществлять транспорт кислорода от легких к тканям организма. Основная сложность эксперимента заключается в том, что человеческий организм обычно «отторгает» чужие биомолекулы. Euro Blood Substitutes собирается привлечь новые инвестиции и общественное внимание к европейским биотехнологиям. Ведь искусственную кровь, в отличие от естественной, можно будет стерилизовать. Именно это позволяет рассчитывать на популярность будущего препарата в Восточной Европе и в Африке, где отмечены частые случаи заражения СПИДом при переливании донорской крови.

Компания «СангуБиоТех» (Виттен, Германия) в эксперименте получила свиной гемоглобин путем применения поперечной сшивки 10 молекул гемоглобина глутаральдегидом. В итоге были синтезированы гигантские полимерные структуры кровяного белка. Доклинические испытания препарата продолжаются. Во всем мире идет поиск универсального искусственного гемоглобина.