Использование антител в иммуноферментном анализе

Успехи в профилактике и лечении различных заболеваний человека, животных или растений в значительной степени зависит от своевременности и точности определения вызвавшего его патогенного микроорганизма. Классические методы микробиологического анализа, несмотря на свою высокую точность, являются весьма длительными, трудоемкими и дорогими. Кроме того, не всегда удается культивировать такие патогенные микроорганизмы как внутриклеточные паразиты или вирусы, а результаты часто бывают ошибочными.

В последнее время для устранения этих принципиальных ограничений были разработаны методы, в основе которых лежат важнейшие достижения биохимии, иммунологии и генной инженерии.

Любой метод выявления патогенных микро­организмов должен быть достаточно простым, быстрым и обладать высокой специфичностью и чувстви­тельностью. Диагностический тест должен давать положительный ответ только на микроорганизм- или молекулу-мишень, обнаруживать очень малые коли­чества такой мишени даже на фоне других мик­роорганизмов или молекул, загрязняющих образец. Простота метода подразумевает, что он является достаточно продуктивным, эффектив­ным и недорогим для рутинного применения.

Одним из наиболее широко применимым методом является иммуноферментный анализ (ИФА) и прежде всего его разновидность- ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA). Процедура его проведения включает следующие этапы (рис.1):

А. Фиксация (закрепление) компонентов анализируемого образца (сыворотка крови, образцы ткани, клетки микроорганизмов) на поверхности твердой подложки (лунки, планшетки).

Б. Добавление раствора антитела (первого антитела) специфичного к определенному, искомому антигену. Если он имеется в анализируемом образце, то произойдет его связывание с антителами. Далее лунку промывают с целью удаления несвязавшихся молекул первого антитела.

В. Добавление раствора другого антитела (второго антитела), способного специфически связываться с первым антителом. Лунку опять промывают для удаления несвязавшихся с первым антителом вторых антител. Второе антитело обычно представляет собой коньюгат (комплекс) с некоторыми ферментами, способными катализировать химические превращения определенных бесцветных веществ (субстратов), которые сопровождаются появлением цветной окраски или свечением (люминисценцией) при облучении УФ-лучами.

Г. Добавление раствора бесцветного субстрата. Если в лунке присутствует комплекс антиген-первое-второе антитела, то наблюдается окраска или свечение, по интенсивности которых судят о содержании искомого антигена и степени протекания болезни.

Рис. 1

Основной принцип ELISA - специфическое связывание первого антитела с определенной молекулой-мишенью. В качестве такой мишени обычно выступает какой либо имуногенный белок патогенного микроорганизма или специфические белки человека, например антитела, свидетельствующие о протекании определенного паталогического процесса в организме. Очищенный препарат таких белков-антигенов используют для получения специфических антител, при помощи которых затем и выявляют данную мишень. Однако антитела, которые образуются в сыворотке (антисыворот­ке) крови иммунизированного животного (обычно кролика или мыши), могут связываться с разными ан­тигенными детерминантами (участками, эпитопами) такой моле­кулы-мишени. Поэтому такую смесь антител называют поликлональным препаратом.

Использование поликлональных антител имеет два недостатка, существенных для методов имунодиагно­стики: 1) содержание отдельных антител в поликлональном препарате может варьировать от од­ной партии к другой, что не обеспечивает однозначности и воспроизводимости анализов; 2) поликлональные антитела нельзя применять, если необходимо различить две сходные мишени, т.е. когда имуногенный белок патогенной формы микроорганизма, например coli-бактерий, вызывающих кишечные инфекции, и непатогенных (E.coli) форм различаются единственной детерминантой. Однако эти проблемы вполне разрешимы, поскольку сейчас научились получать чистые препара­ты антител, выработанных к одной специфической антигенной детерминанте, т. е. препараты моноклональных антител. Применение моноклональных антител поз­воляет существенно повысить специфичность метода ELISA, поскольку они связываются с одним, строго определенным антигенным сайтом. К настоящему времени получен целый ряд моноклональных антител, на основе которых созданы диагностические системы, которые можно исполь­зовать для обнаружения различных соединений и патогенных микроорганизмов.