Образование и отбор гибридных клеток

Первый шаг в процессе получения гибридной клеточной линии, продуцирующей антитела од­ного типа, состоит во введении мышам специфического антигена. После ряда иммунизации, проведенных в тече­ние нескольких недель, проверяют, произошло ли развитие у животных иммунного ответа. Если ответ развился, то животных умерщвляют, из­влекают селезенку, промывают ее, измельчают и несильно встряхивают для высвобождения еди­ничных клеток, среди которых находятся и антителопродуцирующие β-клетки. Взвесь клеток селезенки смешивают со взвесью миеломных клеток, дефектных по гипоксантин-гуанин- фосфорибозилтрансферазе (HGPRT^-). Комби­нированную взвесь в течение нескольких минут инкубируют в 35%-ном полиэтиленгликоле, а затем переносят в среду, содержащую гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда ГАТ).

Обработка полиэтиленгликолем облегчает слияние клеток, тем не менее слияние происходит редко и является в достаточной степени случайным событием. В смеси присутствуют клет­ки миеломы, селезенки, а также слившиеся слетки миеломы - селезенки, миеломы - миеломы, селезенки - селезенки. Однако в среде ГАТ растут только гибридные клетки миеломы -селезенки, все остальные типы клеток не могут в ней пролиферировать. Клетки селезенки и слившиеся клетки селезенки - селезенки вообще нe растут в культуре, а миеломные клетки НGPRT^- и слившиеся клетки миеломы - миеломы не могут использовать гипоксантин в качестве предшественника в процессе биосинтеза пуриновых оснований гуанина и аденина, без которых невозможен синтез нуклеиновых кис-лот. Но у них есть другой естественный путь синтеза пуринов - при участии дигидрофолатредуктазы, поэтому в состав среды и входит аминоптерин, ингибирующий активность этого фермента. Таким образом, миеломные клетки

HGPRT^- и слившиеся клетки миеломы - миеломы не могут синтезировать пурины в среде ГАТ и погибают.

Слившиеся клетки селезенки - миеломы рас­тут в среде ГАТ, поскольку:

1) клетки селезенки поставляют функциональную HGPRT, которая может утилизировать экзогенный гипоксантин среды несмотря на блокирование синтеза пури­нов с участием дигидрофолатредуктазы аминоптерином;

2) клетки миеломы способны ак­тивно делиться. Тимидин необходим для устранения блокирования в синтезе пиримидинов, обусловленного ингибирова-нием дигидро­фолатредуктазы. На 10 - 14-е сутки после слия­ния клеток в среде ГАТ остаются и растут только слившиеся клетки селезенки - миеломы. Их за­тем вносят в лунки пластиковых микротитровальных плашек и выращивают на полной культуральной среде без ГАТ.