Спектри ядерного ефекту Оверхаузера (ЯЕО)

Широке застосування методів розв’язки ССВ (декаплінгу) привело до винайдення ще одного цікавого та корисного явища. Це явище називається ядерним ефектом Оверхаузера (ЯЕО). ЯЕО являє собою зміну інтенсивності сигналу одного ядра при виведенні зі стану теплової рівноваги іншого ядра, що знаходиться, як правило, в тій самій молекулі. Виведення з рівноваги досягається додатковим опроміненням ядра (як при декалінгу), або впливом радіочастотних імпульсів. Так, якщо вибірково опромінити зразок на частоті поглинання одного з протонів, то інтенсивності сигналів інших протонів в спектрі можуть змінитися. Знайдено, що такі зміни відбуваються лише для сигналів тих ядер, що у просторі розташовані поблизу опроміненого ядра. Величина ЯЕО визначається як відносна зміна інтенсивності сигналу, I, у порівнянні з його рівноважною інтенсивністю, I_о :

h_I{S} = (I-I_o)/I_{o *} 100 (%)

де h_I{S} – показує спостережуваний ЯЕО для спіна I, коли опромінюється спінS. Говорять ще, що це ЯЕО спіна I під впливом спіна S. Використання символів I і S взято з оригінальної літератури, де був уперше виявлений ефект Оверхаузера. Хоча це відкриття було зроблене досить давно і спочатку стосувалося ядер металів і електронів, однак позначення збереглися дотепер. Надалі під час обговорення даного ефекту під ядром I ми будемо розуміти досліджуване ядро (Interesting), а під ядром S (Source) збуджуване ядро. Зміни інтенсивності можуть бути як позитивними, так і негативними. Це залежить від знаків гіромагнітних відношень пари ядер і від динамічних властивостей молекули.

7.1. Стаціонарні ЯЕО

Стаціонарні ЯЕО виникають під впливом тривалого слабкого селективного радіочастотного опромінювання ядра S. За таких умов відбувається насичення переходів спіна S. При цьому для інших ядер молекули, що у просторі близькі до S, виникає ЯЕО, який можна виявити методом інтегрування спектрів. Такий підхід є досить розповсюдженим в органічній хімії. Експеримент з дослідження стаціонарних ЯЕО можна реалізувати за допомогою імпульсної послідовності, що показана на Рис. 33.

Рис. 33. Загальна експериментальна схема для спостереження стаціонарного ЯЕО.

Від послідовності, що використовується для вимірювання стандартних одновимірних спектрів ЯМР вона відрізняється лише тим, що на протязі деякого проміжку часу перед імпульсом на зразок подається постійне слабке радіочастотне опромінення, частота якого відповідає частоті поглинання ядра S. Тривалість опромінювання повинна становити 1-5 с, в залежності від часу релаксації ядра S.

7.2. Вимірювання стаціонарних ЯЕО: різницеві спектри

Основною вимогою для експерименту по спостереженню стаціонарних ЯЕО є наявність достатнього періоду переднасичення обраного сигналу перед початком збору даних. Результатом експерименту є отримання спектрів, інтенсивність сигналів у яких змінена в порівнянні зі звичайним одновимірним спектром. Головним питанням є те, як краще представити зміни інтенсивностей сигналів, що спостерігаються. Хоча теоретично можна просто виконати інтегрування сигналів і порівняти їх з інтенсивностями в спектрі без ЯЕО, однак, на практиці такий підхід виявляється недостатньо надійним, оскільки зміни інтенсивності сигналів можуть становити всього декілька відсотків, що може виявитись меншим за точність інтегрування. Замість цього застосовують т. зв. різницеву спектроскопію, при якій спектр порівняння віднімають в пам’яті комп’ютера від ЯЕО-спектра. В отриманому різницевому спектрі в ідеалі будуть присутніми тільки ті сигнали, інтенсивність яких у ході експерименту змінилася, тобто сигнали ЯЕО і негативний пік протона, що насичується. На Рис. 34 показано вихідний спектр сполуки 10 та два варіанти різницевих спектрів, в яких проводилось опромінювання протонів Н2 та Н3. Такий різницевий ЯЕО-експеримент відіграє провідну роль у вивченні будови хімічних сполук протягом багатьох років. Отримані в такий спосіб спектри досить наочні і за їхньої допомоги можуть бути знайдені ЯЕО, величини яких менші за 1%.

Рис. 34. Одновимірний спектр (a) і спектри різницевого ЯЕО (б і в) сполуки 10 в MeOD. У різницевому спектрі містяться тільки сигнали ЯЕО і зрізаний сигнал протона, що насичується, який показано стрілкою. Спостережувані ЯЕО узгоджуються з 2,5-цис орієнтацією замісників у молекулі 10.

Схематично різницевий ЯЕО-експеримент показанона Рис. 35. ЯЕО-спектр вимірюється після попереднього опромінювання обраного сигналу протягом періоду t (період переднасичення). Спектр порівняння вимірюється в ідентичних умовах, за винятком того, що в цьому випадку опромінення сигналу відсутнє. Для того, щоб умови збору даних були цілком ідентичними, що дуже важливо в різницевій спектроскопії, при вимірюванні спектра порівняння додаткове опромінення не вимикається повністю, а його частота зміщується убік від наявних у спектрі сигналів (позарезонансне опромінення). Віднімання отриманих спектрів один від одного (або віднімання отриманих СВІ з подальшим Фур’є перетворенням) дає різницевий спектр.

Рис. 35. Процедура генерації різницевого ЯЕО спектра.

Успіх експерименту сильно залежить від ідентичності умов вимірювання двох спектрів. При невідповідності умов у різницевому спектрі з'являються інтенсивні артефакти віднімання(розфазовані сигнали). Для їхньої мінімізації розроблені спеціальні методи обробки спектрів (Рис. 36).

Рис. 36. Різницеві ЯЕО артефакти. У різницевому спектрі (б) артефакти показані зірочкою. Вони виникають поряд з ЯЕО (позначені як N), коли два схожих, але не повністю ідентичних сигнали віднімаються один від одного. Артефакти можуть бути ослаблені шляхом використання експоненціальної мультиплікації – помноження кривої СВІ на експоненціальну функцію (в).

7.3. Застосування спектрів ЯЕО

ЯЕО можна використовувати для вирішення різноманітних стереохімічних задач. Слід зразу відмітити, що всі висновки щодо будови сполук треба робити лише виходячи з фактів наявності ЯЕО. Висновки, що базуються на відсутності ЯЕО, є некоректними. Основним для успіху застосування ЯЕО є мінімум конформаційних переходів у молекулі, оскільки у протилежному разі експеримент дає усереднені значення ЯЕО, які далеко не завжди можна правильно проінтерпретувати. Іншою необхідною умовою успіху експериментів з ЯЕО є присутність у молекулі достатнього числа протонів. Якщо молекула містить лише 1-2 протони, то висновки, що базуються на ЯЕО, стають ненадійними. Такі умови виконуються для багатьох молекул, що синтезуються у хімічних лабораторіях. Для оптимального розділення сигналів буває необхідним підібрати відповідний розчинник. Наведені надалі в прикладах знайдені величини ЯЕО є типовими при рутинних дослідженнях. Застосування інших методик ЯЕО буде описано в наступних параграфах.

7.3.1. Знаходження структури Е- та Z- ізомерів

Прикладом використання стаціонарних ЯЕО може служити стереохімічне віднесення ізомерів 11а й 11б. В них окремі протони знаходяться на різній відстані один від одного і, відповідно, дають різні ЯЕО. Z-ізомер легко ідентифікується за наявністю ЯЕО між олефіновим протоном і метиленовою групою СН₂Si, що дає сигнал у вигляді характерного синглету у сильному полі. Подальше підтвердження цьому можна отримати при вивченні ЯЕО для протонів ізомерного продукту. В даному випадку має місце ЯЕО між двома зближеними у просторі протонами метиленових груп. Одночасно ЯЕО для олефінового протона ізомеру Е відсутній.

Ізомери сполуки 11

Наведений приклад ілюструє також правила подання результатів вимірювань ЯЕО. Саме так слід наводити спостережувані ефекти при розв’язанні задач даного посібника. Напрямок стрілки вказує протон, для якого спостерігається ЯЕО, а початок стрілки – протон, що опромінюється.

7.3.2. Визначення будови кістяку ароматичних сполук

Наведемо ще один приклад ефективного використання ЯЕО. При проведенні реакцій внутрішньомолекулярної конденсації та гетероциклізації поліфункціональних сполук часто виникають випадки, коли вдається виділити чистий індивідуальний продукт, будова якого теоретично може мати два або більше варіанти. Часто в альтернативних структурах маємо однакові спінові системи, що не дозволяє здійснити вибір структури на базі ССВ. В таких випадках використання ЯЕО може виявитися незамінним. Так, в ході реакції було отримано конденсований гетероцикл 12, що може мати ангулярну (А) або лінійну (Б) будову:

А Б

Обидва варіанти будови сполуки 12 теоретично можуть мати в ¹Н‑ЯМР спектрах по дві спінові системи ABCD та синглети двох ароматичних протонів та метильної групи. З формули видно, що в ангулярному варіанті А міститься фенантреноподібний фрагмент, в якому два ароматичних протони знаходяться дуже близько один від одного. Відповідно, для них повинен спостерігатися ЯЕО, що за величиною наближається до максимального. В лінійній структурі Б такої ситуації не виникає. Таким чином, виявлення великого ЯЕО буде свідчити на користь ангулярної структури А. Як видно з наведених експериментальних величин ЯЕО, отримано саме ангулярну структуру А. Додаткові експерименти по виявленню ЯЕО між іншими протонами підтверджують зроблені висновки.

Якщо висновки про структуру молекули доводиться робити, базуючись на невеликих ЯЕО, що сягають лише 1-5%, слід особливу увагу приділити віднесенню сигналів ароматичних протонів, оскільки для певності результатів треба точно знати, між якими саме сигналами спостерігається ЯЕО. Є емпіричні дані, згідно з якими між довільними орто-протонами ЯЕО може досягати 10%, а між протонами у пері-положеннях – навіть 12-15%. При цьому видимі ЯЕО можуть бути і значно меншими через присутність розчиненого кисню, механічні домішки тощо. Таким чином, іноді зробити надійні висновки про структуру кістяка ароматичних сполук виявляється не дуже просто.

7.3.3. Спектроскопія NOESY-2D

Недоліком експериментів по отриманню різницевих спектрів ЯЕО є те, що їх доводиться повторювати для кожного з протонів сполуки. Тільки тоді можна отримати повну картину ЯЕО-взаємодій. Для спрощення експерименту розроблена двовимірна методика, що дає змогу в одному експерименті отримати всі наявні ефекти ЯЕО. Вона називається NOESY. Принцип отримання двовимірного набору даних в експерименті NOESY цілком аналогічний до того, що був описаний для експерименту COSY. Відмінність полягає в тому, що в цьому випадку кроспіки відповідають ЯЕО-кореляціям між відповідними протонами. Для того, щоб показати читачеві практичну цінність методу NOESY, наведемо приклад застосування методу для вивчення двох органічних сполук, одна з яких має просту будову, а друга - достатньо складна.

Перша сполука є заміщеним кумарином, що має будову 13:

В спектрі, що наведений на Рис. 37, є кроспік між ароматичними віцинальними протонами 5Н та 6Н, розташованими поруч один з одним. Аналогічний кроспік ми б бачили в спектрі COSY.

Рис. 37. Спектр NOESY сполуки 13. Кореляції між сигналами протонів позначено горизонтальними та вертикальними лініями.

Для ідентифікації кроспіку корисно від нього провести горизонтальну та вертикальну лінії до перетину з діагоналлю. На точках перетину будуть міститися діагональні піки протонів, між якими виник відповідний ЯЕО. Для названих кореляцій такі лінії проведено нижче від діагоналі. Крім того, на відміну від відповідного спектра COSY, в спектрі містяться кроспіки між сигналом 4-СН₂ групи та сигналами протонів 3Н та 5Н, між якими знаходиться даний замісник. У даному випадку між протонами немає ССВ, але вони розташовані в просторі достатньо близько один від одного для виникнення помітного ЯЕО. Аналогічні кроспіки виникають і між сигналами 7-ОСН₃ групи та сигналами протонів Н6 та Н8. Таким чином, зі спектру легко провести віднесення сигналів метоксильних груп та підтвердити положення замісників у молекулі. Даний приклад наочно показує, як метод NOESY можна використати для підтвердження будови молекул.

На Рис. 38 показаний набагато більш складний спектр NOESY природного терпеноїду андрографоліду8у ДМСО-D₆. Нижче, на формулі сполуки представлена схема найважливіших кореляцій, що можна дістати з NOESY спектру. На спектрі знак піків виділений кольором. Позитивні сигнали позначено червоним кольором, а негативні – чорним. Видно, що більшість кроспіків мають знак, протилежний до знаку діагональних піків. Це відображає той факт, що знак ЯЕО в цьому випадку повинен бути позитивним. У декількох кроспіків в області 3-6 м.ч. знак збігається зі знаком діагональних піків. Ці кроспіки відповідають гідроксильним протонам і воді. Вони обумовлені протонним обміном. Таким чином, на спектрі ми можемо відрізнити кроспіки, зумовлені ЯЕО від кроспіків, зумовлених явищем хімічного обміну.

Рис. 38 2D NOESY спектр терпену андрографоліду8в ДМСО‑D₆ при 25°C.

Аналіз спектру проводиться цілком аналогічно тому, як це було показано у попередньому випадку. Для інтерпретації спектру від кожного зі знайдених кроспіків проводиться горизонтальна та вертикальна лінії до перетину з діагоналлю спектру. Ці лінії повинні закінчуватись на двох діагональних піках, між якими виник кроспік. Наприклад, в спектрі на Рис. 38 є кроспік між сигналами з хімічними зсувами 3,1 м.ч. та 3,7 м.ч., що відповідає наявності ЯЕО між протонами Н^k та H^j. У даному випадку наявність кроспіку є цілком передбачуваною, оскільки названі протони, як це витікає з формули сполуки, є гемінальними. У таких складних випадках, як той, що розглядається, найчастіше недостатньо мати оглядовий спектр, що містить всі кореляції, оскільки кроспіки можуть виявитися занадто малими. Найчастіше складний спектр розбивають на декілька ділянок, де містяться кроспіки і кожну з них записують окремо у зручному масштабі. Кожний такий фрагмент спектра аналізують окремо, а результати записують в таблицю, де зведено знайдені кореляції для кожного з наявних сигналів. Наприкінці аналізу таблиця міститиме всі наявні кроспіки ЯЕО. Подальший аналіз структури виконують вже без спектрів, а лише з табличними даними. Такий підхід є найбільш систематичним і запобігає виникненню помилок.

Звісно, щоб проаналізувати результати експерименту NOESY потрібно, щоб до його проведення вже було виконано віднесення сигналів у протонному спектрі. Тому аналізу спектру NOESY зазвичай передує вивчення спектрів COSY, що дозволяють знайти спіновий зв’язок між ядрами, а отже, спростити віднесення відповідних сигналів. Крім того, бажано мати просторову модель досліджуваної молекули, або кілька варіантів моделей для альтернативних структур. Їх можна отримати або за допомогою комп’ютерного моделювання, або шляхом побудови молекули з моделей типу Дрейдингу. Лише співставлення наявних кроспіків з отриманими за допомогою молекулярного моделювання між’ядерними відстанями дозволяє зробити висновки про геометричну будову молекули.

8. Гетероядерна кореляційна спектроскопія

У попередніх параграфах ми окремо розглянули спектри на ядрах ¹Н та ¹³С. Кожний з видів спектрів дозволяє отримати певний обсяг інформації про будову сполуки, що досліджується. Однак, слід зауважити, що інтерпретація протонних спектрів, тобто віднесення сигналів до конкретних магнітних ядер є набагато простішою, ніж вуглецевих спектрів, оскільки завжди ми можемо аналізувати не лише хімічні зсуви, а й розщеплення сигналів завдяки ССВ, що дозволяє знайти місце ядра серед інших магнітних ядер молекули. При аналізі вуглецевих спектрів такої можливості часто немає, оскільки більшість з них вимірюється за умов декаплінгу. Тому дуже ефективними є методики, що дозволяють визначити кореляцію між протонним та вуглецевим сигналами, яка базується на гетероядерних ССВ. Це означає, що у випадках, коли сигнали у протонному спектрі віднесені, то можна визначити сигнали ¹³С тих атомів вуглецю, що віддалені від протона на 1 хімічний зв’язок, або на 2-3 хімічних зв’язки. Таку задачу вирішують методи так званої гетероядерної кореляційної спектроскопії. Вона являє собою сукупність методик, що дозволяють виявити наявність хімічного зв’язку між ядрами різних типів. Найбільш часто ці методики використовуються для пар ядер ¹Н-¹³С та ¹Н-¹⁵N. Не можна сказати, що методики непридатні для встановлення кореляцій з іншими ядрами, наприклад ¹Н - ¹⁴N або навіть ³¹Р и ¹³С. Але ці можливості використовуються значно рідше. Найчастіше знаходять кореляції ¹Н‑¹⁵N у протеїнах і пептидах. На відміну від методів редагування вуглецевих спектрів за мультиплетністю сигналів, методи гетероядерної кореляційної спектроскопії дозволяють не лише визначити кількість протонів, що зв’язані з кожним атомом вуглецю, а і з’ясувати, який саме протон у молекулі зв'язаний з певним гетероатомом (найчастіше атомом вуглецю). Знайдена в такий спосіб гіпотетична структура молекули може бути підтверджена або спростована при подальших дослідженнях.

8.1. Кореляції через один хімічний зв’язок. МетодHMQC

Існують два експерименти, що дозволяють знайти кореляцію між сигналами протонів та сигналами безпосередньо зв’язаних з ними атомів вуглецю. Ці експерименти мають абревіатури HSQC та HMQC. Візуально вони майже не розрізняються, тому можна використовувати будь-який з них. Ми розглянемо лише один експеримент – HMQC. Як видно з його англійської абревіатури (Heteronuclear Multiple Quantum Correlation), він є експериментом з гетероядерної багатоквантової кореляції. Як і двовимірні спектри, що були розглянуті раніше, спектр HMQC являє собою квадрат або прямокутник. Одна з осей спектру HMQC відповідає шкалі хімічних зсувів протонів, а друга - шкалі хімічних зсувів ¹³С. Часто спектр подають у такому вигляді, коли вздовж осей зображено відповідні одновимірні спектри. Кореляції проявляються у вигляді кроспіків, що розташовані на перпендикулярах, які проведено через відповідні сигнали в одновимірних спектрах. Таким чином, наявність кроспіку свідчить, що існує безпосередній хімічний зв’язок між протоном і атомом вуглецю, що містяться навпроти кроспіка у відповідних одновимірних спектрах. Метод дозволяє легко віднести сигнали всіх зв’язаних з протонами атомів вуглецю.

Для того, щоб одразу дати читачеві змогу зрозуміти, наскільки важливу інформацію можна отримати зі спектра HMQC, наведемо двовимірний HMQC спектр для простої сполуки - ментолу 14.

Рис. 39. Кореляції через один зв'язок у спектрі HMQC ментолу 14. Вздовж відповідних осей показані також одновимірні протонний і вуглецевий спектри.

Двовимірний гетероядерний кореляційний спектр HMQC є виключно простим для інтерпретації. В одному вимірі він містить сигнали атомів вуглецю за умов повної розв’язки від протонів, а у другому вимірі – звичайний протонний спектр. Координати кроспіку відповідають хімічним зсувам в протонному та вуглецевому спектрах тих ядер, між якими існує прямя ССВ, а отже, які зв’язяні одним хімічним зв’язком. Наприклад, найнижчий кроспік у спектрі на Рис. 39 відповідає кореляції протона з хімічним зсувом 3,32 м.ч. та атома вуглецю з хімічним зсувом 72 м.ч. Сигнал протона при 3,32 м.ч. відповідає атому Н-1 сполуки 14, оскільки саме цей сигнал повинен розташовуватися в найбільш слабкому полі завдяки впливу електронегативного атому кисню. Наявність кроспіка дозволяє стверджувати, що між атомами ¹Н та ¹³С з названими хімічними зсувами існує хімічний зв’язок, тобто у вуглецевому спектрі сигнал при 72 м.ч. відповідає протону С-1. Аналогічно можна віднести і сигнали інших зв’язаних з протонами атомів вуглецю. Єдиною умовою для цього є попереднє віднесення сигналів у протонному спектрі. Його, у свою чергу, можна провести за допомогою спектрів COSY.

Немає якогось усталеного розташування осей в спектрах HMQC. Вісь протонів може бути як вертикальною, так і горизонтальною, в залежності від уподобань спектроскопіста. Але це жодним чином не впливає на результати аналізу спектру. Якщо сигналів в протонному та вуглецевому спектрах не занадто багато, кореляції можна зробити візуально. Якщо ж спектр хоча б вздовж однієї осі містить сигнали, що близькі за хімічними зсувами, слід провести вертикальну та горизонтальну лінії від кроспіка до відповідних шкал, чи сигналів в одновимірних спектрах, що містяться вздовж осей (якщо вони записані). Рисунок ілюструє три найбільш важливі результати експерименту. По-перше, з'являється можливість використання знайдених раніше віднесень протонних сигналів для віднесення сигналів у спектрах гетероядер. Такий підхід веде до значно більшої певності структурних висновків. Немає іншого методу, за допомогою якого було б настільки просто віднести сигнали у вуглецевому спектрі. По-друге, з'являється можливість рознесення нерозділених протонних сигналів у другому вимірі відповідно до хімічних зсувів гетероядра. Це дозволяє уточнити віднесення в протонному спектрі. Наприклад, область між 0,7 і 1,2 м.ч. на рис. 39. містить ряд протонних сигналів, що перекриваються і погано піддаються аналізу навіть на частоті 500 МГц. Повна картина цих сигналів видна в другому вимірі, що дозволяє ідентифікувати і віднести всі 7 сигналів.

Цінність такого підходу зростає при ускладненні структури молекули і зростанні числа сигналів, що перекриваються. Останній аспект експерименту може бути винятково корисним для структурних віднесень, оскільки з’являється можливість ідентифікувати діастереотопні гемінальні пари протонів. Їх не завжди легко ідентифікувати за COSY спектром, тому що гемінальні та віцинальні КССВ можуть мати однакові величини. Тільки для гемінальних пар протонів мають місце дві кореляції з одним вуглецевим атомом.На рис. 39 це спостерігається для С6, С4 і С3. На відміну від попередніх гомоядерних 2D спектрів, що наведені у цій книзі, гетероядерні кореляційні спектри не містять діагональних піків і не симетричні відносно діагоналі.

Слід зауважити, що бувають випадки, коли протонному сигналу не відповідає жоден кроспік. Це є надійним свідченням того, що протон, який утворює даний сигнал, зв’язаний не з атомом вуглецю, а з якимось іншим атомом, наприклад, азотом або киснем. Цю властивість спектрів HMQC теж можна використовувати для інтерпретації спектрів.

8.2. Кореляція гетероядер з протонами через 2-3 зв’язки. Метод НМВС

Розглянутий раніше метод HMQC базується на наявності зв'язку гетероатома із протоном. Тому його не можна застосувати, наприклад, для віднесення сигналів не зв’язаних з протонами атомів вуглецю. Доповнюючим підходом у таких випадках є встановлення кореляцій за рахунок ССВ між атомами вуглецю і протонами, що віддалені один від одного більш ніж на один хімічний зв'язок. Це так звані далекі або багатозв’язкові кореляції. Найчастіше їх виявляють в експериментах по багатозв’язкових ¹³С-¹Н кореляціях за допомогою методики НМВС (Heteronuclear Multiple Bond Correlation). У більшості випадків при цьому виявляється ССВ вуглецю із протонами, що знаходяться від нього на відстані двох-трьох хімічних зв'язків, оскільки більш далекі КССВ, як правило, занадто слабкі. Ідентифікація Н-С кореляції через зв'язки вуглець-вуглець і вуглець-гетероатом дає можливість одержати за допомогою НМВС інформацію про кістяк молекули і є одним з найбільш потужних підходів до встановлення будови органічних молекул, що поступається хіба що малочутливій методиці INADEQUATE.

Вигляд спектру НМВС подібний до вигляду спектру HMQC. Тут координатні осі також відповідають одновимірним спектрам на ядрах вуглецю та на протонах. Далекі кореляції кожного протона знаходяться на прямій, що відповідає його хімічному зсуву і проходить через його сигнал в одновимірному спектрі перпендикулярно до шкали протонних хімічних зсувів. Взаємна орієнтація осей не є усталеною і може бути довільною. Інтенсивності кроспіків залежать від типу гетероядер, величин дальніх КССВ та настроювання імпульсної послідовності даної методики. На практиці настроювання імпульсної послідовності здійснюють за допомогою керуючого інтервалу D (див далі).

Одержання інформації з НМВС спектра проілюструємо на прикладі сполуки 15(рис. 40).

Рис. 40. HMBC спектр далеких кореляцій для сполуки 15, записаний з керуючим інтервалом D = 60 мс

Якщо віднесення всіх протонних та вуглецевих сигналів вже проведене, то, як це показано на Рис. 40, відповідні ядра можна позначити прямо на осях двовимірного спектра. У цьому разі одразу видно, з якими ядрами вуглецю є кореляції в сигналів кожного з протонів. Всі вони знаходяться на вертикальних лініях одна під одною. (Якщо у виміряному спектрі вісь протонів була б вертикальною, то всі протонні кореляції розташовувалися б на одній горизонталі). Найбільш інтенсивні кореляції спостерігаються для метильних груп, оскільки намагніченість для них відповідає трьом протонам одночасно і спінова система є найпростішою. Менш інтенсивні кореляції відповідають протонам зі складними мультиплетами в протонних спектрах.

Результати аналізу двовимірного спектру HMBC можна представити у вигляді таблиці, що дуже зручно для аналізу стереохімічної будови молекули. Прикладом такої таблиці є Табл. 16. Слабкі кореляції, які відповідають маленьким константам ССВ, позначені як (w) (не всі вони спостерігаються на Рис. 40 на вибраному нижньому рівні контурної карти).

Табл. 16. Список далеких кореляцій, що спостерігаються в HMBC спектрі (D = 60 мс) сполуки 15

Основні принципи інтерпретації спектрів даного типу можна простежити на прикладі аналізу кореляцій сигналу Н-2. Насамперед слід зазначити, що в спектрі впадає в око наявність кореляції через один зв'язок з утворенням дублета при 93 м.ч. Вона повністю еквівалентна кореляції, яка спостерігалася б у спектрі HMQC і може служити для ідентифікації даного сигналу. На Рис. 40 такі кореляції показані стрілками. Можливість появи таких піків завжди слід враховувати при інтерпретації спектрів даного типу. На вертикальній лінії, що проходить через сигнал Н-2 в одновимірному спектрі, окрім очевидних кореляцій з ядрами вуглецю С9 і С10, відзначаємо наявність кореляцій із С4 і С5, що зумовлені ССВ через гетероатоми (N і О). Такі кореляції можуть бути особливо цінними за відсутності протон-протонних взаємодій. Так, у спектрі Н-Н-COSY сполуки 15 не спостерігається Н2-Н5 кроспіків, але кореляція Н2-С5 в НМВС доказує наявність не більш ніж 3 хімічних зв’язків між С2 і С5. Нарешті, слід зазначити, що Н2 дає кореляцію з вуглецевим атомом С8, не зв’язаним безпосередньо з протонами. Цей атом є „невидимим” в експериментах по кореляції через один зв'язок. Можливість спостерігати цим методом не зв’язані з протонами вуглецеві центри дозволяє не тільки визначити їхні хімічні зсуви, але й одержати цінні дані щодо зв’язаності атомів. Комбінація COSY, HMQC і НМВС є в більшості випадків достатньою для знаходження зв’язаності атомів в невеликих (молекулярна маса до 600) органічних молекулах.

На наявність далеких кореляцій в спектрах НМВС впливає ряд структурних факторів молекули речовини, що досліджується. Знання цих факторів необхідне для оптимізації експериментів, тому зупинимося на них детальніше. Далекі протон-вуглецеві КССВ через два або три зв’язки можуть мати досить суттєві відмінності, в залежності від структури молекули (Табл. 17).

Таблиця 17. Типові значення (Hz) протон-вуглецевих далеких констант розщеплення

Шлях Шлях Шлях

Розщеплення^{a 2}Jch розщеплення ³Jch розщеплення ⁴Jch

^aГетероатоми, такі як O, N і т.д. також можуть бути включеними в шляхи розщеплення замість атомів С.

^bтранс- > цис-, цис- звичайно <10 Гц.

^c у випадку W-конформації

Як бачимо, величини далеких С-Н КССВ можуть розрізнятися майже на порядок. Особливо великою різниця є в ароматичних сполуках. Таким чином, послідовність неможливо оптимізувати одночасно для всіх наявних КССВ. Найчастіше її оптимізують для невеликих КССВ, щоб найбільш повно виявити кореляції для четвертинних атомів вуглецю. Для рутинних досліджень використовують компромісну величину керуючого интервалу D = 60-80 мс.

Для виявлення малих КССВ величину інтервалу D можна збільшити навіть до 200 мс. При використанні ще більш довгих інтервалів вдається детектувати С-Н кореляції через 4 зв’язки, котрі можуть проявлятися у випадках, коли молекула має жорстку конформацію із зигзагоподібним розташуванням атомів (W-взаємодія). Для жорстких молекул величини КССВ через 3 зв’язки інколи можуть бути більшими, ніж КССВ через 2 зв’язки. При цьому для них спостерігається залежність від діедрального кута, схожа на залежність Карплуса. Таким чином, для даних структур можуть з’явитися труднощі в тому, щоб розрізнити кореляції через 2 і 3 зв’язки за допомогою НМВС. Більше того, через те, що на інтенсивності кроспіків впливає декілька факторів, часто на основі спектрів не вдається точно встановити зв’язаність в кістяку молекули, тим більше, що деякі кореляції можуть бути близькими до нуля.

При вимірюванні спектрів НМВС ароматичних сполук також можуть виникати певні ускладнення. Тут у багатьох випадках КССВ через 2 зв’язки сягає 40-50 Гц, а ³J_НС становлять лише 5-10 Гц. Тому загальновживана величина D мало підходить для кореляцій через 2 хімічних зв’язки. Внаслідок цього в спектрах ароматичних сполук, що виміряні за стандартних умов, коли D настроєна на ^2-3J_CH = 8 Гц, кореляції через 3 зв’язки мають значно більшу інтенсивність, ніж кореляції через 2 зв’язки. Дуже часто кореляції через 2 зв’язки не проявляються взагалі. Якщо все ж необхідно виявити такі кореляції, слід величину D зменшити в 2-3 рази і записати додатковий варіант спектра з новими параметрами.

8.3. Спільне використання методів HMQC/HMBC для віднесення сигналів ¹³С

Розглянемо, яким чином гетероядерну кореляційну спектроскопію можна використати для повного віднесення сигналів у вуглецевому спектрі нескладної органічної сполуки, що має будову 16.

Перш за все, вимірюються протонний та вуглецевий спектри сполуки. Вони слугуватимуть для позиціювання кроспіків у двовимірних спектрах. Після цього проводять віднесення сигналів у протонному спектрі. Якщо сигнали спостерігаються окремо, то зробити це вдається, базуючись на їхній мультиплетності та положенні в спектрі. У більш складних випадках слід долучити до цього вивчення спектри Н,Н-COSY. Фрагменти протонного та вуглецевого спектрів, що містять сигнали ароматичних протонів та атомів вуглецю, наведено на осях двовимірних спектрів на Рис. 41 та 42. Після віднесення протонних сигналів можна вимірювати та обробляти спектри HMQC та НМВС. Нижче наведено ці спектри для сполуки 16.

Рис. 41. Спектр HMQC сполуки 16. Для збільшення масштабу спектру сигнал метильної групи не показаний.

Рис. 42 Спектр НМВС сполуки 16. У спектрі присутні сигнали домішки - диметилформаміду - при 2,7 та 2,9 м.ч.

Обробка гетероядерних кореляційних спектрів полягає у визначенні координат кроспіків у мільйонних частках. На наведених рисунках всі кореляції для кожного з протонних сигналів містяться на горизонтальних лініях, що можна провести на двовимірному спектрі через відповідний протонний сигнал. В спектрі HMQC кожному протонному сигналу відповідає лише одна кореляція, оскільки кожен протон має зв’язок лише з одним вуглецевим атомом. На відміну від цього, кількість кореляцій, що відповідають кожному з протонних сигналів в спектрі НМВС може бути достатньо великою, залежно від того, скільки вуглецевих атомів відокремлені від протона на 2-3 хімічних зв’язки, але всі вони будуть розташовані на одній горизонталі. Якщо кроспік не знаходиться на жодній з горизонталей, які проведені через центри протонних сигналів, то він відповідає або сигналу домішки, або взаємодії через один хімічний зв’язок. Такі кроспіки слід ігнорувати. При аналізі складних спектрів для виявлення координат всіх кореляцій буває необхідним записати окремо кілька фрагментів двовимірного спектру у потрібному масштабі. Результати такої обробки зручно представляти у вигляді таблиці.

Таблиця 18. Гетероядерні кореляції, знайдені для сполуки 16.

Дані, що зведені у таку таблицю, аналізувати набагато простіше, ніж ті, що є у самому двовимірному спектрі, хоча, звісно, вони є ідентичними. Відсутність кореляції HMQC для якогось протонного сигналу свідчить про те, що даний протон сполучений не з атомом вуглецю. Таку ситуацію ми бачимо в Табл. 18 для сигналів протонів NH в області 11-12,5 м.ч. Найзручніше проводити віднесення сигналів, якщо зобразити структурну формулу сполуки і послідовно записувати біля магнітних ядер величини хімічних зсувів, що їм відповідають, дістаючи їх з отриманих кореляцій. Перш за все, відносять Н-заміщені атоми вуглецю, оскільки зробити це набагато легше. Для цього використовують спектр HMQC. Після цього починають віднесення четвертинних (незаміщених атомами водню) атомів вуглецю. Найважливіші кореляції НМВС доцільно показувати викривленими стрілками. Починати віднесення слід з сигналів, що відповідають найпростішим структурним фрагментам. Так, базуючись на віднесеному сигналі протона 1-NH можна знайти хімічні зсуви близьких до нього четвертинних атомів С2, С3, С4а, С8а. На початку аналізу отримані у такий спосіб величини хімічних зсувів не слід вважати кінцевими, оскільки треба, щоб знайдені віднесення узгоджувались зі всіма знайденими кореляціями. Результат віднесення для сполуки 16 наведено на Рис. 43. Тут кореляції HMQC не показані, а стрілками позначено лише кореляції НМВС, що послужили основою для віднесення сигналів не зв’язаних з протонами атомів вуглецю.

Рис. 43 Віднесення сигналів та схема найважливіших НМВС-кореляцій для сполуки 16.

Даний результат аналізу гетероядерних кореляцій можна без особливих змін використовувати для публікацій у спеціальній літературі, або будувати на його базі відповідні таблиці, що аналогічні до Табл.18. Часто віднесення сигналів можна перевірити альтернативним методом, наприклад, за допомогою ЯЕО (на Рис. 43 результат експерименту з ЯЕО позначений стрілочкою з підписом “NOE”). При вирішенні задач, що розміщені в другій частині посібника, слід будувати схему кореляцій, приклад якої наведено на Рис. 43.