Ускладнення, що виникають у спектрах ROESY

Як відзначалося раніше, у спектрах ROESY, окрім піків, що пов'язані із крос-релаксацією, можуть з'являтися піки, які пов'язані із протіканням під час дії спінового замка також і інших процесів. Вони можуть мати таку природу:

- кроспіки типу COSY, що проявляються між J-зв'язаними спінами;

- перенесення TOCSY між J-зв'язаними спінами;

- послаблення кроспіків внаслідок позарезонансний ефектів

Перший різновид сигналів пов'язаний з тим, що тривалий імпульс спінового замка діє аналогічно останньому імпульсу в послідовності COSY, тому він індукує когерентність J-зв'язаних спінів. Отримані піки мають вигляд звичайних протифазних сигналів COSY невеликої інтенсивності, тому їхня наявність не занадто заважає інтерпретації спектра. Значно більшу проблему являють собою перенесення TOCSY. Це пов'язане з тим, що тривалість спінового замка в експерименті ROESY практично така сама, як і в експерименті TOCSY (розділ 5.21). Тому між J-зв'язаними спінами може відбуватися ефективне перенесення когерентності. Це відбувається у найбільшій мірі для зв'язаних спінів, що мають однакову за абсолютною величиною різницю хімічного зсуву та частоти передавача, тобто для сигналів, які розташовані симетрично відносно центра спектру. Такі умови часто виконуються в спектрах таких природних сполуках як вуглеводи, нуклеїнові кислоти, пептиди, алкалоїди і стероїди. На додаток до небажаних прямих ефектів TOCSY, може відбуватися багатокроковий процес передачі намагніченості, що включає кроки TOCSY і ВСК-ЯЕО. У результаті в спектрі можуть з'явитися сигнали помилкових ВСК-ЯЕО, які не пов'язані з реальними ВСК-ЯЕО-кореляціями. Так, наприклад, перенесення TOCSY від спіну А до спіну В і наступне перенесення ВСК-ЯЕО від В до С (Рис. 6.9) приведе до виникнення кроспіка, що підтверджує наявність ВСК-ЯЕО між А і С. Зворотні кроки ВСК-ЯЕО-TOCSY дадуть аналогічний сигнал, однак в обох випадках висновки виявляться помилковими. Оскільки при перенесенні TOCSY фаза сигналу зберігається, його внесок у кроспік залишається непомітним і може привести до цілком помилкових висновків. Різні шляхи перенесення намагніченості, які можуть реалізовуватися в експериментах ROESY, наведені в табл. 6.3.

Таблиця 6.3.Сигнали, що спостерігаються в експерименті ROESY

Рис. 6.9.Помилкові ROE піки в ROESY спектрі можуть виникати через одночасне протікання ROE і TOCSY.

При проведенні експериментів ROESY особливу увагу слід приділити виключенню зі спектрів піків TOCSY. Найпростішим методом є вибір для частоти передавача такого значення частоти, щоб піки в спектрі не могли бути розташованими симетрично відносно нього. Можна також вимірювати два спектри з різною частотою передавача. Зсув частоти досить мало позначається на сигналах ROE, але істотно міняє інтенсивності сигналів TOCSY. Порівняння таких спектрів дозволяє надійно ідентифікувати сигнали в спектрі. Для зменшення інтенсивності сигналів TOCSY можна також модифікувати імпульс, що створює спіновий замок (Рис. 6.10).

Рис. 6.10.Схеми імпульсів змішування для ROESY експерименту, (a) одиничний, малопотужний імпульс, (б) імпульсний спіновий замок включає послідовність імпульсу з малим кутом і коротким проміжком, що багаторазово повторюється і (в) Tr-ROESY спіновий замок з альтернуванням фази.

При цьому можна використовувати малопотужне радіочастотне опромінення (Рис. 6.10а) з gB₁ того ж порядку, що і максимальна відстань сигналів від частоти передавача (близько 2-3 кГц) або імпульсний спіновий замок (Рис. 6.10б). Недавно було показано, що для ефективного придушення перенесення TOCSY можна використовувати спіновий замок з альтернуванням фази (Рис. 6.10в). Такий експеримент називають Tr-ROESY (transverse). У цьому випадку сигнали TOCSY виявляються ефективно придушеними. В експерименті Tr-ROESY вимірюються середні величини між ROE і ЯЕО, оскільки вектор намагніченості проводить якийсь час як у поперечній площині, так і уздовж поздовжньої осі z. Це пов'язане з тим, що траєкторія руху вектора намагніченості нагадує рух маятника (Рис. 6.11).

Рис.6.11.Маятниковий рух спін-замкнених векторів протягом дії змішувальної послідовності Tr-ROESY.

Таким чином, через усереднення інтенсивність кроспіків виявляється зменшеною у порівнянні із істинним ROESY. Для малих молекул (w_ot_c <<1) втрати інтенсивності теоретично відсутні. Для середніх молекул (w_ot_c =1) інтенсивність сигналів може бути знижена вдвічі, а для дуже великих молекул (w_ot_c >>1) – в 4 рази. Видно, що для молекул середнього розміру, для яких вимірювання спектрів ROESY є найдоцільнішим, маємо компромісну величину послаблення сигналів. Метод вимагає, щоб сила радіочастотного поля, gB₁ була вдвічі більшою, ніж діапазон сигналів у спектрі (gB₁ звичайно становить 4-6 кГц). Успіх експерименту у великому ступені залежить від точності калібрування 180^о імпульсу. Ефективність придушення небажаних піків TOCSY даним методом показана на Рис. 6.12 для тетрамерного карбопептоїда 6.3.

Рис.6.12.Спектр ROESY тетрамерного карбопептоїда 8.21записаний(a) з одиничним 2.6 кГц безперервним імпульсом спінового замка і (б) зі спіновим замком Tr-ROESY з альтернуванням фази із частотою 3.7 кГц при 4.5 м.ч. У спектрі (a) домінують TOCSY піки які мають таку саму фазу, що й діагональні сигнали. У спектрі (б) вони значною мірою усунуті, що дає можливість виявити істинні піки ROE

Видно, що в спектрі (б) сигнали TOCSY виявилися ефективно подавленими.

Третій фактор, що ускладнює застосування ROESY, полягає в ослабленні інтенсивності кроспіків, залежно від їхньої відстані від частоти передавача (центра спектрального діапазону). Особливо це стосується кількісних експериментів ROESY. Для усунення такої залежності розроблені послідовності ROESY з компенсацією. Саме їх варто використовувати для визначення чисельних значення ROE.