Будова лімфоїдних органів.

Імунні клітини утворюються і проходять "освіту" в первинних лімфоїдних органах: кістковому мозку і тимусі. Тут формується набір їх поверхневих маркерів, які визначають диференціацію по функціям, та репертуар специфічностей. Звідси лімфоцити мігрують у вторинні лімфоїдні органи, де знаходяться для виконання своїх функцій. Первинні і вторинні лімфоїдні органи не є простим накопиченням лімфоїдних клітин, а мають певну упорядковану будову.

Тимусскладається із декількох долей, кожна з яких має коркову та мозкову частини (зони). Основу їх складають епітеліальні клітини, що синтезують гормони тимуса – ростові фактори, необхідні для диференціювання та созрівання Т лімфоцитів. В корковій частині знаходяться так звані "клітини-няні" – великі епітеліальні клітини з багатьма відростками, які експресують МНС ІІ. Вони утворюють мережу, крізь яку в процесі созрівання мігрують Т лімфоцити. На кордоні коркової і мозкової частин знаходиться шар макрофагів. У мозковій зоні – дендритні і епітеліальні клітини, що експресують як МНС І, так і МНС ІІ. Т лімфоцити із кісткового мозку поступають в коркову зону тимуса. Там проходить перший етап позитивного відбору. Загиблі клітини, що не пройшли перших пунктів контролю, знищуються шаром макрофагів. Остаточне дозрівання Т лімфоцитів відбувається в мозковій зоні, звідки вони зрілими виходять на периферію.

Коркові лімфоцити кортизол-чутливі, тобто стероїдні гормони наднирників викликають їх загибель. Кортизол – один із факторів, що сприяє апоптозу клітин, відбракованих в результаті позитивного відбору. Мозкові Т лімфоцити резистентні до дії кортикостероїдів, по перше, за рахунок наявності ферменту 20-a-гідроксилстероїддегідрогенази, а по-друге, за рахунок підвищення експресії гену bcl-2. Це було продемонстровано в експериментах з трансгенними мишами, нокаутованими по генам bcl-2 і bax. Ці миші жили нормально до двох тижнів після народження, а потім у них зникали (гинули) всіТ і В лімфоцити. У цей період у мишей починають синтезуватися глюкокортикоїди адреналін і норадреналін, що виділяються під дією стресу, і цих рівнів достатньо, щоб знищити всі лімфоцити, якщо вони не захищені продуктом гену bcl-2.

Лімфатичні вузлитеж мають коркову, паракортикальну та мозкову зони. Зверху вони вкриті капсулою. Лімфоцити входять в лімфовузли крізь синуси із ретикулярних клітин і рухаються в напрямку від коркової до мозкової зони, звідки виходять зовні. В лімфовузлі В і Т клітини розділені по компартментах. В клітини знаходяться переважно в корковій зоні, де утворюють первинні і вторинні (утворені після антигенної стимуляції) фолікули. Саме тут утворюються зародкові центри, де відбуваються процеси соматичних мутацій, відбору і утворення клітин пам’яті. Т лімфоцити знаходяться в паракортикальній зоні. Плазматичні клітини, утворені в результаті диференціювання і созрівання В клітин, виходять із лімфовузлів крізь мозкові синуси.

Селезінкатеж вкрита капсулою і складається із червоної та білої пульпи. Червону пульпу складають еритроцити і макрофаги. Серед червоної пульпи знаходяться ділянки білої пульпи, яку складають лімфоїдні клітини. Кожна ділянка білої пульпи має крайову зону, де містяться В клітини, фолікули, і утворюються зародкові центри, та серединну область, де містяться Т лімфоцити. Плазматичні клітини знаходять у крайовій зоні між червоною та білою пульпою.

Лімфоїдна тканина слизових оболонок– це дифузні групи клітин: лімфоцитів, макрофагів,- що знаходяться в легенях, кишечнику, апендіксі, складають Пейєрові бляшки та мигдалини. Загальна маса цієї тканини досить велика: так, у двох метрах кишечника кількість лімфоцитів така, як в кістковому мозку, селезінці та лімфовузлах разом. Вони розташовані упорядковано, утворюючи В- і Т-зони. В Пейєрових бляшках існують окремі зони gd-Т лімфоцитів. В лімфоцити слизових оболонок продукують переважно IgA та IgE.

2. Міграція лімфоцитів. Молекули адгезії.

Шлях розвитку лімфоцитів і їх відповідь на чужорідні антигени пов’язані із міграцією в організмі тварини чи людини. Утворення лімфоцитів починається в кістковому мозку, тобто на внутрішній поверхні трубчастих кісток. Там відбувається розподілення на лімфоїдні та мієлоїдні попередники. Частина лімфоїдних попередників диференціюється до незрілих IgM⁺ В лімфоцитів. Вони залишають кістковий мозок із венозною кров’ю, рухаються до серця і переходять до артеріальної крові. Попередники Т лімфоцитів мігрують до тимуса, де диференціюються до CD4⁺ або CD8⁺ Т лімфоцитів. Вони також залишають тимус із венозною кров’ю, проходять крізь серце і виходять в артеріальну кров. З артеріальною кров’ю Т і В лімфоцити потрапляють до вторинних лімфоїдних органів і периферичних тканин. Обмін між кровоносними та лімфоїдними судинами відбувається на рівні лімфовузлів. Лімфоцити входять в лімфовузли з кров’ю крізь венули високого ендотелію, а виходять із лімфою крізь медулярні синуси. Лімфоїдні судини об’єднуються в грудний лімфоїдний проток (ductus thoracicus), який впадає в грудну вену (vena subclavia). Таким чином лімфоцити знов потрапляють до венозної крові і коло циркуляції замикається.

На шляху від кісткового мозку і тимусу лімфоцити заселяють вторинні лімфоїдні органи. Незрілі В лімфоцити потрапляють до селезінки крізь центральні артеріоли і крайові синуси і накопичуються у білій пульпі, що оточує артеріолу. Там відбувається негативна селекція проти аутоантигенів, яких немає в кістковому мозку. В лімфоцити дозрівають до IgM⁺IgD⁺ і утворюють первинні фолікули. Т лімфоцити також входять до селезінки крізь крайові синуси и накопичуються в серединній частині острівців білої пульпи. В лімфовузлах В і Т лімфоцити зосереджуються відповідно в кортикальній і паракортикальній зонах. У вторинних лімфоїдних органах більшість лімфоцитів знаходиться до імунної відповіді.

Попередники клітин, що представляють антиген, мігрують у тканини і там диференціюються в макрофаги і дендритні клітини. Таким чином, до початку імунної відповіді лімфоцити і клітини, що представляють антиген, сегреговані: лімфоцити знаходяться здебільшого у вторинних лімфоїдних органах, а клітини, що представляють антиген, - у тканинах. Після втручання антигену дендритні клітини транспортують його до найближчого лімфоїдного органу, де відбувається активація Т і В лімфоцитів і їх взаємодія. Активовані ефекторні клітини (ЦТЛ, Тх) мігрують до очагу запалення або інфекції. І, нарешті, утворені клітини пам’яті мають розподілитися по всій імунній системі.

Таким чином, всі процеси як до-імунного розвитку лімфоцитів, так і їх участі в імунній відповіді пов’язані з міграцією від одних органів організму до інших. Рух клітин не є хаотичним. Він упорядкований наявністю певних "сигналів руху" та "адресних кодів", які визначають, до якого саме органу прямує певна клітина. Так, активовані лімфоцити, якщо їх вилучити із тіла і ввести знов в іншому місці, набувають здатності повертатися в той орган, де відбулася активація.

Міграція клітин в організмі керується молекулами адгезії та хемокінами.

В міграції лімфоцитів приймають участь два типи молекул адгезії.

1. Селектини– глікопротеїди, N-кінцевий домен яких гомологічний Са²⁺-залежним лектинам. Вони присутні тільки на лейкоцитах і ендотеліальних клітинах судин, тобто специфічні саме для взаємодії цих клітин між собою.

L-cелектини постійно експресуються на лімфоцитах, моноцитах і дендритних клітинах, але відсутні на клітинах пам’яті. Їх афінність зростає після активації лімфоцитів.

P-селектини експресуються на ендотеліальних клітинах та тромбоцитах і з’являються на поверхні в результаті екзоцитозу із внутрішньоклітинних гранул під дією TNF-a, гістаміну, тромбіну і компонентів комплементу.

Е-селектини також знаходяться на ендотеліальних клітинах судин і їх синтез стимулюється TNF-a і ІЛ-1.

Лігандами селектинів є вуглеводи, зв’язані з муцинами – білками клітинних мембран, багатими на серин та треонін. Всі вони містять сіалову кислоти і фукозу, а ліганди L-селектинів сульфатовані. Взаємодія селектинів з їх лігандами є низько афінною і оберненою.

2. Інтегрини- це білки, що складаються із нековалентно зв’язаних a і b субодиниць з характерними структурними мотивами. Відомо принаймні 12 типів інтегринів, які приймають участь в адгезії лімфоцитів.

Лігандами інтегрінівє мембранні білки - члени суперродини імуноглобулінів (наприклад, ICAM – “intra-cellular adhesion molecule”, міститься на багатьох клітинах, в тому числі лімфоцитах; VCAM – "vascular cell adhesion molecule", міститься на ендотеліальних клітинах судин; MadCAM – "mucosal adressin cell adhesion molecule", міститься на слизових оболонках), а також білки позаклітинного матриксу (колаген, ламінін, фібронектин), компоненти системи згортання крові і системи комплементу. Взаємодія інтегринів з їх лігандами є більш високо афінною.

Хемокіни та їх рецептори.

Явище хемотаксису широко відоме в клітинній біології, це рух клітин по градієнту концентрації атрактанта (речовини, що приваблює). Наприклад, С5а компонент комплементу є хемоатрактантом для моноцитів, нейтрофілів і еозинофілів, лейкотрієни є атрактантами для моноцитів і нейтрофілів. В 1991-92 роках було відкрито особливий тип речовин, названих хемокінами. Це поліпептиди із 70-80 амінокислотних залишків, які продукуються різними тканинами організму і є специфічними до різних субпопуляцій лімфоцитів. Саме вони визначають напрямок і ефективність міграції лімфоцитів в організмі.

На сьогодні відомо більш ніж 50 різних хемокінів. Їх класифікують на чотири родини в залежності від будови цистеїн-багатої області на N-кінці: С, СС, СХС, С3ХС. В залежності від фізіологічних функцій хемокіни поділяють на гомеостатичні (або конституційні) та запалювальні (або індуковані). Гомеостатичні хемокіни постійно продукуються в шкірі і слизових оболонках і визначають рух клітин за нормальних умов: заселення вторинних лімфоїдних органів в процесі розвитку лімфоцитів, транспортування антигену, патрулювання організму клітинами пам’яті. Запалювальні хемокіни починають продукуватися клітинами уражених тканин під дією цитокінів запалення (ІЛ-1b, TNFa). Вони приваблюють у місце запалення ефекторні Т лімфоцити, а також моноцити і гранулоцити. Така класифікація не є абсолютною, оскільки деякі хемокіни виконують як гомеостатичні, так і запалювальні функції.

Лімфоцити можуть відчувати градієнт хемокіну в 1% впоперек свого діаметру і рухаються в бік найвищої концентрації.

Рецептори до хемокінів – це трансмембранні білки, що сім разів перетинають мембрану і тому їх називають серпентиновими (змієподібними) рецепторами. Вони зв’язані з G-білком, який активує фосфоліпазу Сb2. Відповідно до родин хемокінів, їх рецептори теж поділяють на родини СХСR, CCR CX3CR. На сьогодні відомо 18 хемокінових рецепторів. Різні типи клітин (моноцити, дендритні клітини, лімфоцити) і різні субпопуляції лімфоцитів мають рецептори різних специфічностей. Взаємодія конституційних хемокінів з рецепторами високо специфічна (тобто один хемокін взаємодіє лише з певним рецептором), що визначає дуже точну адресу міграції лімфоцитів. Наприклад, попередники В лімфоцитів затримуються в кістковому мозку під дією хемокіну SDF-1 (CXC), що продукується кістковим мозком і ембріональною печінкою. Попередники Т лімфоцитів прямують до тимусу під дією хемокіну ТЕСК, що продукується дендритними клітинами тимусу. На відміну, взаємодія індукованих хемокінів із рецепторами має до певної міри вироджений характер, тобто кожний рецептор може зв’язати декілька хемокінів, а один хемокін може взаємодіяти з декількома рецепторами. Така виродженість сприяє масовій міграції ефекторних клітин в очаг запалення.

Міграція клітин в організмі відбувається за участю і взаємодії молекул адгезії та хемокінів. Це було показано на прикладі діапедезу – міграції клітин крізь стінку судини. Так лімфоцити потрапляють до лімфоїдних органів і до тканин організму. Діапедез відбувається у так званих пост-капілярних венулах – частині венозної системи, яка починається відразу після артеріальних капілярів. Стінки венул складаються з одного шару ендотеліальних клітин, що експресують молекули адгезії і є чутливими до дії медіаторів запалення.

Було запропоновано багатокрокову модель руху (Рис. 20). Згідно до цієї моделі, клітина, що рухається із током крові, за звичайних умов не контактує із стінкою судини. В результаті ураження, стресу чи запалювання ендотеліальні клітини починають експресувати Р-селектин. Це відбувається дуже швидко, на протязі хвилин, тому що Р-селектин зберігається у внутрішньоклітинних гранулах і екзоцитується на мембрану. Пізніше з’являється синтезований Е-селектин і ліганди інтегринів, ICAM-1, VCAM-1. Первинний контакт із стінкою судини відбувається за рахунок взаємодії Р- і Е-селектинів ендотеліальних клітин з відповідними лігандами на лімфоцитах, а також L-селектинів лімфоцитів з лігандами на ендотеліальних клітинах. Взаємодія ця низькоафінна і короткочасна, в результаті клітина "котиться" по стінці судини.

Хемокін, що продукується, наприклад, клітинами лімфоїдного органу чи у місці запалення, направляє рух клітини у потрібний бік (по градієнту концентрації). При цьому лімфоцит стає полярним і змінює організацію свого цитоскелету. Дія хемокіну також змінює адгезивні властивості інтегринів на поверхні лімфоциту: відбуваються їх конформаційні зміни, в результаті чого афінність взаємодії з відповідними лігандами на ендотеліальних клітинах підвищується в 200 разів. За допомогою інтегринів лейкоцити зупиняються і щільно приєднуються до стінки судини. Механізм діапедезу остаточно не з’ясований. Показано, що приєднання клітини до стінки судини призводить до дисоціації молекул адгезії, так званих кадхеринів, що зв’язують між собою ендотеліальні клітини, і таким чином полегшує “протискання” лімфоциту крізь шар ендотеліальних клітин. Невідомо, як лімфоцит проходить крізь базальну мембрану судини: механічно порушує шар колагену і ламініну або ензиматично їх розщеплює.

Таким чином, процес міграції лімфоцитів із судини до тканини складається з таких етапів:

- приєднання до судини (селектини);

- катіння по стінці (селектини);

- активація – експресія додаткових рецепторів, зміна конформації інтегринів (хемокін);

- зупинка і посилення зв’язку з судиною (інтегрини);

- діапедез.

Ендотелій судин у різних органах і тканинах має різний набір молекул адгезії. Відповідно, субпопуляції лімфоцитів і клітини різних ступенів активації експресують різні адгезивні молекули. Оскільки селектинів, хемоатрактантів та інтегринів існує досить багато різновидностей, то для кожного типу клітин і кожного напрямку іх міграції можна визначити свій "поштовий індекс" – адресний код, де перша цифра – тип селектину, друга – тип хемоатрактанту і третя – інтегрину.

Вважають, що є окремі потоки лімфоцитів: ті, що циркулюють через шкіру, шлунково-кишковий тракт, легені, і ті, що постійно знаходяться в лімфоїдних тканинах. Однак лімфоцити, що циркулюють, час від часу проходять крізь лімфовузли, селезінку і лімфоїдну тканину слизових оболонок.

Тепер розглянемо, як відбувається міграція клітин в процесі імунної відповіді. Попередники клітин, що представляють антиген, мігрують із кісткового мозку в тканини і там диференціюються в макрофаги і дендритні клітини. Таким чином, до імунної відповіді лімфоцити і клітини, що представляють антиген, сегреговані: лімфоцити знаходяться здебільшого у вторинних лімфоїдних органах, а клітини, що представляють антиген, - у тканинах. Т і В лімфоцити теж роз’єднані у спеціальних зонах лімфоїдних органів. Для розвитку імунної відповіді їх необхідно об’єднати в одному місці. Антиген потрапляє в організм крізь зовнішні кордони – шкіру і слизові оболонки, де він в першу чергу контактує із дендритними клітинами. Наприклад, при ураженні шкіри антиген поглинається так званими клітинами Лангерганса. За звичайних умов клітини Лангерганса щільно з’єднані з кератиноцитами шкіри за рахунок гомофільної адгезії Е-кадхеринів. Цитокіни запалення, що супроводжує ураження шкіри, зокрема TNFa, знижують рівень експресії кадхеринів на клітинах Лангерганса і змінюють тип їх рецепторів до хемокінів, зокрема з’являється рецептор CCR7. Такі клітини можуть мігрувати до найближчого лімфовузла і входити в нього крізь венули високого ендотелію. Це особливий тип ендотелію, який експресує ліганди L-селектинів GlyCAM-1 і CD34, ліганд інтегринів ICAM-1, а також хемокін SLC, який зв’язується з CCR7. Дендритні клітини експресують МНС ІІ, а також секретують хемокіни MDC і TARC, які приваблюють Т лімфоцити в паракортикальній області. Якщо рецептор Т лімфоцита підходить до антигенного пептиду, то дендритна клітина експресує додаткові адгезивні молекули, Т лімфоцит ділиться і активується. Цей процес займає 2-4 дні. В корковій зоні лімфовузла антиген представлений іншим типом дендритних клітин – фолікулярними дендритними клітинами. На відміну від дендритних клітин паракортикальної області, фолікулярні дендритні клітини не процесують антиген, а представляють його в інтактній формі у вигляді імунних комплексів з антитілами або комплементом. На фолікулярних дендритних клітинах антиген може зберігатися на протязі років (!) і служити активатором відповідних В лімфоцитів. Взаємодія з нативним антигеном стимулює первинну активацію В лімфоцитів. Тепер попередньо підготовлені Т і В лімфоцити повинні зустрітися. Активовані Т лімфоцити мігрують до В-зони (коркової) і активують В лімфоцити, які, в свою чергу, мігрують до первинних фолікулів, проліферують і утворюють зародкові центри. Їх приваблює хемокін BLC, що продукується фолікулярними дендритними клітинами, і взаємодіє з рецептором CXCR5 на В лімфоцитах. Хемокіни MDC і TARC стимулюють взаємодію активованих Тх з передактивованими В лімфоцитами. Таким чином, міграція не тільки зводить разом усіх учасників імунної відповіді, але й диференціює активовані лімфоцити від неактивованих. Антиген, представлений фолікулярними дендритними клітинами служить фактором відбору для В лімфоцитів, гени яких підлягають соматичним мутаціям. В результаті відібрані клітини проліферують, в них відбувається переключення класів імуноглобулінів, утворюються плазматичні клітини і клітини пам’яті, які мігрують до мозкової зони лімфовузла і виходять в циркуляцію крізь мозкові синуси. Слід зазначити, що неактивовані (наївні) лімфоцити і клітини пам’яті входять в лімфовузли різними шляхами: клітини пам’яті – через тканинний ендотеліум, а наївні клітини – через венули високого ендотелію. Наївні і клітини пам’яті розрізняються по експресії адгезивних молекул; також розрізняються між собою клітини пам’яті, що циркулюють у різних частинах тіла.

Селезінка не має венул високого ендотелію, і лімфоцити мігрують до неї із капілярів так званої крайової зони. Далі вони рухаються до білої пульпи і розділяються по В і Т компартментах. В лімфоцити крайової зони і фолікулів білої пульпи відрізняються за своїми властивостями. Дозрівання імунної відповіді в фолікулах селезінки відбувається до певної міри аналогічно такому в лімфовузлах. Плазматичні клітини, що утворилися, мігрують до червоної пульпи і там залишаються.

Кожний орган тіла характеризується своїм типом ендотелію із унікальним набором адгезивних молекул і хемокінів. Так, вхід в Пейєрові бляшки через високий ендотелій дозволено при наявності на лімфоциті L-селектину, a4b7 і a4b2 інтегринів, а на ендотелії – молекул MadCAM – 1 та ICAM-1. Адресою шкіри є набір Р- і Е-селектинів, хемокіну МСР-1 та лігандів інтегринів VCAM-1 і ІCAM-1,2, лімфоцити при цьому повинні нести інтегрини a4b1 і a4b2 та специфічний ліганд селектинів CLA (Cutaneous Lymphocyte Associated antigen).

В процесі розвитку лімфоцитів відбувається зміна молекул адгезії. Так, Т лімфоцити в ембріональному стані експресують a4b7 та aЕb7 інтегрини, а через тиждень після народження починають експресувати L-селектин. Спектр молекул адгезії змінюється і після активації. Так, активовані Т лімфоцити підвищують експресію CD44, CD2, LFA-1, ICAM-2, інтегринів a₁b₁, a₂b₁, a₃b₁, a₅b₁, a₆b₁. Т лімфоцити, спрямовані до дії в слизових оболонках, втрачають L-селектин, специфічний до лігандів лімфовузлів, але зберігають a4b7 інтегрин, необхідний для входу в слизові оболонки. Це означає, що в процесі життя спектр "життєвих інтересів" лімфоцита змінюється, що знаходить відображення у типах молекул адгезії, які визначають як здатність лімфоцитів взаємодіяти між собою, так і шляхи їх міграції.

Активовані ефекторні лімфоцити і клітини пам’яті мігрують до місця втручання антигену. Відповідні хемокіни утворюються в результаті неспецифічної відповіді, запалення. Запалення також посилює міграцію лімфоцитів в лімфоїдні органи: посилюється ток крові і полегшується вхід клітин пам’яті в лімфовузли.

Антиген, що потрапляє в організм різними шляхами, індукує відповідь у різних лімфоїдних органах:

- антигени їжі впізнаються лімфоцитами Пейєрових бляшок та апендиксу; активовані лімфоцити мігрують через мезентеральні лімфовузли у грудний проток і кров;

- антигени, що потрапляють крізь дихальні шляхи (респіраторні інфекції), впізнаються язичними, ньобними та глоточними мигдалинами (гланди і аденоїди), підглоточними лимфовузлами і лімфоїдною тканиною легенів;

- антигени, що потрапили через шкіру, відносяться до найближчих лімфовузлів;

- за знищення генералізованої інфекції в крові відповідає селезінка.