Приклади делецій.

1. Якщо клітини зародкового тимусу культивувати разом із клітинами зародкової печінки іншого генотипу, то утворюються Т клітини, серед яких нема ЦТЛ до МНС як тимусу, так і печінки.

2. У мишей із штучно зруйнованими (нокаутованими) генами Mls (суперантигенів) відбувається накопичення клітин із певними типами T-рецепторів, які не знищуютьсяв результаті негативного відбору.

3. У мишей, трансгенних по НУ-специфічним T-рецепторам, більшість Т клітин специфічна до НУ-антигену – антигену, що присутній тільки в організмі самців. У самців таких мишей спостерігалися масові делеції Т лімфоцитів: залишалося менше 5% тимусу.

4. У мишей, трансгенних по мембранній формі лізоциму (більшість зрілих клітин мають на поверхні лізоцим курчати) в селезінці і лимфовузлах не було В клітин, специфічних до лізоциму, хоча в кістковому мозку знаходили багато їх попередників. Попередники могли визріти в культурі, але в миші – гинули. Коли таких мишей зробили трансгенними по bcl-2, то величезні кількості незрілих лізоцим-специфічних клітин накопичувалися в селезінці, кістковому мозку, крові (посилена експресія гену bcl-2 запобігала їх апоптозу).

5. Важливість апоптозу для нормального розвитку імунної системи було продемонстровано на прикладі так званих lpr-мишей. Ці миші мають гіпертрофовані лімфоїдні органи і величезні кількості лімфоцитів, що не пройшли негативного відбору. Подібне захворювання було в 1993 році ідентифіковано і у людини: це так званий аутоімунний лімфопроліферативний синдром (ALPS). В обох випадках, і у мишей і у людей, було знайдено мутацію по гену fas, продукт якого, як зазначалося у попередній лекції, і є головним провідником апоптозу в живих клітинах.

Таким чином, експериментально було показано, що значна кількість Т і В лімфоцитів, що утворюються після позитивного відбору, гине в результаті взаємодії з власними антигенами. Однак не всі власні антигени присутні в тимусі в той час, коли там іде негативний відбір. Толерантність до тканиноспецифічних антигенів утворюється на периферії, як правило, шляхом клональної анергії.

Приклади анергії.

1. Було створено трансгенних мишей двох типів. Миші А мали посилену експресію розчинного лізоциму курчати: у них в сироватці і тканинних рідинах було багато лізоциму. Миші В були трансгенні по антитілам до лізоциму: більшість їх В клітин мали специфічність до лізоциму курчати. Якщо нормальні зрілі В лімфоцити мишей В переносили в мишу А, вони ставали анергізованими – не здатними відповідати на антиген. При перенесенні в інше середовище їх функції відновлювалися.

2. Коли мишей А і В схрестили між собою, то у нащадків всі В клітини стали анергізованими. Час життя їх скоротився від 4-5 тижнів до 3-4 днів.

3. Шляхом використання мишей, трансгенних по лізоциму, що містили різні концентрації лізоцима в сироватці, було з’ясовано, що для толерізації (анергізації) Т клітин достатньо 10^-10 М антигену, а для анергізації В клітин – на два порядки більше, тобто 10^-8 М. Із цього видно, що першими толерізуються Т клітини, активність яких є більш критичною для розвитку імунної відповіді.

У наведених вище прикладах анергія наступала при наявності високої концентрації антигену за браком костимуляторних сигналів.

Для більшості аутоантигенів нормальною формою їх нерозпізнання власною імунною системою є так зване ігнорування свого. Воно означає, що більшість власних антигенів знаходиться в організмі в концентраціях, нижчих за поріг розпізнання, деякі з них захищені тканиноспецифічними бар’єрами, і характер процесингу їх у нормі такий, що не сприяє їх імунному розпізнанню. Доказом такого стану речей є існування численних аутоімунних захворювань, коли за певних умов метаболізм аутоантигенів змінюється і імунна система починає їх впізнавати як чужерідні.

Приклад ігнорування.

Вірусний білок трансфектували в організм миші під інсуліновим промотором, тобто він синтезувався тільки в клітинах підшлункової залози, де експресується ген інсуліну. В нормі у цих мишей не спостерігалося імунної реакції (наявності ЦТЛ) на вірусний білок. Але якщо до організму вводили живий вірус, то клітини підшлункової залози руйнувалися ЦТЛ. Замість вірусу, достатньо було лише підняти рівень ІЛ-2. Це означало, що за звичайних умов потенційно чужерідний антиген підшлункової залози не був спроможний активувати імунну систему і відповідь на нього не розвивалася по типу ігнорування. Живий вірус сприяв появі ІЛ-2, необхідного для активації ЦТЛ.

Метою негативного відбору є модифікувати репертуар Т і В лімфоцитів так, щоб вони не завдавали шкоди власному організмові і, з іншого боку, були достатніми для елімінації чужих антигенів. Найбільшу небезпеку складають Т клітини (Тх та ЦТЛ), тому вони підлягають селекції у першу чергу (менші концентрації антигену для толерізації). Однак при цьому залишається ризик наявності аутоантитіл, тому при більшій концентрації антигену стають толерантними і В клітини.

Для Т лімфоцитів контроль є більш простим, тому що репертуар, який утворюється в тимусі, практично не змінюється на периферії. Аутоімунні Т клітини делетуються, частина анергізується. Після виходу із тимусу Т клітини ше деякий час чутливі до толерізації, але значна частина з них залишається потенційно аутореактивними і не відповідає на свої антигени не тому, що не може їх впізнати, а за браком костимуляторних сигналів або за низькою концентрацією антигену. Ці клітини – потенційні провідники аутоімунності.

Для В лімфоцитів контроль є більш складним, оскільки в результаті гіпермутагенезу в зародкових центрах з високою вірогідністю утворюються аутореактивні В-рецептори. Такі клітини частково знищуються шляхом апоптозу за браком позитивного відбору (за відсутності аутоантигенів в зародковому центрі). Якщо аутоантиген присутній, В клітина може бути знищена, але у неї знов є шанс вижити, використавши механізм редагування рецептору і змінивши свою специфічність за рахунок іншого легкого ланцюга.

В процесі розвитку і В, і Т клітини проходять стадію, коли їх взаємодія з антигеном призводить скоріше до толерізації, ніж до активації. Так, якщо ввести розчинний антиген через 6 днів після імунізації, коли зародкові центри ще тільки утворюються, то він заважає утворенню клітин пам’яті і провокує толерантність.

Важливо, що як позитивний, так і негативний відбір у первинних лімфоїдних органах опосередкований власними пептидами. Для В клітин, що підлягають мутагенезу у зародкових центрах вторинних лімфоїдних органів, фактором відбору є чужерідний антиген, представлений на дендритних клітинах фолікулів. Баланс між виживанням клітини і її знищенням, залежить від інтегральної авідності взаємодії клітини з антигеном:

- при мінімальній авідності сигналу нема (апоптоз);

- при середній – позитивний відбір;

- при високій – негативній відбір – апоптоз або анергія.

Авідність взаємодії залежить від структури пептиду, його концентрації, а також від густини антиген-специфічних рецепторів на лімфоцитах. Таким чином, один і той самий пептид може бути фактором як позитивного, так і негативного відбору. Позитивний і негативний відбір може переходити одне в одного при зміні концентрації антигенного пептиду або незначних змінах в його структурі. Це є основою того, що модифікація аутоантигену може призвести до аутоімунної відповіді. Отже, позитивний відбір, тобто виживання специфічних клітин відбувається тільки у досить вузькому діапазоні авідностей взаємодії антигену із антиген-специфічним рецептором.