Лекція 1. Загальні уявлення. Місце імунології серед інших наук. 4 страница

Є декілька модифікацій цього методу.

1) Радіальна дифузія по Манчіні, коли один із компонентів вносять безпосередньо в гель, а другий – в лунку, вирізану в гелі. Дифузія антигену (антитіла) із лунки утворює при досягненні точки еквівалентності кільце преципітації, радіус якого залежить від концентрації антигену і антитіл.

2) Преципітація в гелі по Ухтерлоні. Обидва компоненти вносять у лунки, вирізані в гелі, і вони дифундують назустріч одне одному. Утворюються дуги преципітації, положення і форма яких залежать від концентрації антигену і антитіл.

3) Імуноелектрофорез – поєднання електрофорезу та імунопреципітації. У класичному варіанті, антиген вносять у лунку, з якої він мігрує під дією електричного струму і розподіляється на фракції в гелі. Антитіла вносять у канавку, що вирізано вздовж геля. Фракції антигену дифундують назустріч антитілам і утворюють дуги преципітації, кількість і положення яких характеризують даний антиген і антитіла. Такий підхід використовують для аналізу суміші антигенів в біологічних рідинах, або складних бактеріальних антигенів.

4) Модифікацією імуноелектрофорезу є ракетний електрофорез, у якому антиген розділяється електрофоретично, а гель, куди він потім дифундує, містить антитіла. Дуги преципітації в такому випадку утворюються у вигляді ракет; чим більше концентрація антигену, тим вище ”ракета”.

5) При перехресному імуноелектрофорезі спочатку розділяють електрофорезом антиген, а потім електричний струм накладають в перпендикулярному напрямку в гель, що містить антитіла. Це вже більш кількісний метод, тому що за площею пику можна розрахувати концентрацію антигену.

2. Аглютинація.

Якщо антитіла додавати не до розчинного, а до корпускулярного антигену (наприклад, до клітин бактерій), то утворюється не преципітат, а аглютинат. У природних умовах це механізм знищення бактерій, а в експерименті він може бути використаний для визначення у суміші наявних антигенів чи антитіл. Як корпускулярний антиген часто використовують еритроцити. Ці червоні клітини крові утворюють аглютинат, який добре видно неозброєним оком. Певна річ, так можна виявити тільки антитіла до антигенів еритроцитів. Щоб розширити можливості цього методу, еритроцити модифікують бажаним антигеном. Так, методом гемаглютинації можна визначити антитіла до будь-якого розчинного антигену. Замість еритроцитів, можна взяти забарвлені кульки, наприклад, частки полімерного латексу, модифікованого потрібним антигеном; тоді це називається латекс-аглютинацією.

3. Аналіз антигенів та антитіл за допомогою мітки.

Методи преципітації в агарі дозволяють визначати мікрограмові кількості антигену. Революційним кроком в імунохімічному аналізі стало використання радіоактивних міток, започатковане у 70-х роках, яке дозволило підвищити чутливість методу на шість порядків: стало можливим визначати пікограмові кількості антигену.

Першим ізотопом, яким стали мітити білки, був ¹³¹І. Робота з ним була складною і небезпечною, тому що цей ізотоп випромінює жорстку гамма-радіацію і має дуже короткий період напіврозпаду – 8 діб. Пізніше перейшли на більш зручний ізотоп ¹²⁵І, який дає м’яке гамма- і бета-випромінювання і має період напіврозпаду півтора місяці. Він легко приєднується до тирозинових залишків в білках і по сьогодні широко використовується в експериментах. Якщо треба помітити білок, що синтезується в досліджуваних клітинах, використовують метіонін, мічений ³⁵S, який додається в культуральне середовище і включається у синтезовані білки; це так і називається – біосинтетична мітка.

Радіоімунний аналіз (РІА) є потужним методом визначення k_а. Суть його полягає в тому, що антиген, мічений радіоактивним ізотопом, може бути легко кількісно ідентифікований у будь-якій суміші. Завданням є розділити зв’язаний і вільний антиген. Для цього часто використовують метод преципітації у розчині; осад відділяють від розчинного антигену центрифугуванням. Полегшити утворення преципітату можна за допомогою других антитіл (анти-імуноглобулінових) або висадивши комплекс сульфатом амонію. Цей підхід має певні обмеження, оскільки деякі антигени теж висаджуються сульфатом амонію. Можна також використати нерозчинні частки (найчастіше використовують гранули агарози), до яких пришито якійсь агент, що зв’язує антитіла та їхні комплекси з антигеном. До таких агентів відносяться білки А і G. Ці білки входять до складу мембран стафілококків і мають властивість міцно зв’язувати імуноглобуліни певних класів за їх Fc фрагмент. Експеримент проводять таким чином. Спочатку до антигену додають специфічні антитіла, інкубують деякий час разом, щоб утворився комплекс, а потім додають гранули агарози з білком А (G) і комплекси антиген-антитіло відділяють від антигену, що не зв’язався, шляхом центрифугування. В осаді визначають зв’язаний антиген, а в супернатанті – вільний.

В останні двадцять років широко розповсюджено сорбційні імунологічні методи. Суть їх у тому, що один із компонентів системи антиген-антитіло сорбують на твердій фазі (полістиролі або нітроцелюлозі). Комплекс антиген-антитіло теж утворюється на твердій фазі і може бути відділений від вільного антигену шляхом простого відмивання.

Радіоімунні методи є високочутливими, але все ж таки небезпечними для людей, що їх використовують, і потребують спеціальних мір захисту від радіації, спеціальних заходів по захованню радіоактивних відходів. Розпад ізотопів теж накладає обмеження на їх використання. Тому багато зусиль було прикладено для того, щоб розробити метод, який по чутливості не уступав би радіоімунному, але був більш зручним і небезпечним. Такими виявилися імуноферментні методи.

Суть цих методів полягає в тому, що антитіла ковалентно кон’югують із ферментом, продукт реакції якого легко визначити по забарвленню, флуоресценції, зміні кислотності чи електричного потенціалу.

Перевага ферментної мітки над радіоактивною полягає у тому, що ферменти:

- нешкідливі для здоров’я людини;

- стабільні при зберіганні;

- реакція розвивається з часом і кількість накопиченого продукту реакції з часом зростає.

Найбільш поширені ферменти, які використовують для мітки, - пероксидаза та лужна фосфатаза. Субстратом пероксидази є перекис водню. Як правило, до реакції додають так званий хромогенний субстрат, який перетворюється у спряженій реакції продуктом розкладення перекису водню. В результаті утворюється забарвлений продукт, який можна ідентифікувати просто оком, під мікроскопом або фотометрично, в залежності від типу експерименту. Для пероксидази такими субстратами є, наприклад, о-фенилендіамін, діамінобензидин та a-хлоро-1-нафтол.

Постановка експериментів.

1. Мічений антиген. Визначення концентрації антигену у біологічному матеріалі.

Мічений антиген змішують із специфічними антитілами у різних співвідношеннях, щоб отримати криву зв’язування і визначити кількість антигену, необхідну для зв’язування всіх антитіл (Рис. 5А). Вибирають таку концентрацію антигену, щоб зв’язування антитіл знаходилося в лінійному діапазоні кривої, як правило, 50% від насичення. Далі, змішавши мічений антиген і антитіла у такому співвідношенні, починають додавати немічений антиген – отримують криву конкуренції зв’язування міченого антигену неміченим. (Рис. 5Б). Якщо тепер, замість неміченого антигену, додати пробу, що містить невідому кількість антигену, по кривій конкуренції можна розрахувати, скільки антигену міститься у пробі.

У цьому методі, так само, як і для визначення k_а, необхідно розділити мічений антиген, що зв’язався з антитілами, і вільний антиген. Для цього також використовують преципітацію або сорбційні підходи. Як правило, для цього використовують радіоактивно мічений антиген.

2. Мічені антитіла. Визначення антитіл.

Найбільш поширеним зараз є метод сорбційного імуноферментного аналізу (ІФА), який англійською мовою називається красивим словом ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Суть його полягає в тому, що антиген сорбують на поверхні лунки полістирольного планшету. Сорбція неспецифічна і йде за фізико-хімічними законами. Природа зв’язків білків із поверхнею пластика досі не з’ясована. Якщо антигену недостатньо, щоб закрити всі потенційні центри зв’язування, другим кроком лунку блокують нейтральним білком (наприклад, сироватковим альбуміном). Потім додають розчин, що містить антитіла. Антитіла зв’язуються з сорбованим антигеном, а ті, що не зв’язалися, відмиваються (спеціальним розчином або просто водою). Тепер необхідно виявити антитіла, що зв’язалися. Для цього, як правило, використовують другі антитіла (антитіла проти перших антитіл), мічені ферментом. Їх теж інкубують у лунках, відмивають ті, що не зв’язалися, а потім додають розчин субстрату. Фермент починає перетворювати його, і накопичення забарвленого продукту пропорціональне кількості зв’язаних других, а значить, і перших антитіл (Рис. 6А)

У такій постановці експерименту теж можна визначати антиген. Якщо разом із першими антитілами додати розчинний антиген, то він буде конкурувати із сорбованим за зв’язування з антитілами, і антитіл на твердій фазі зв’яжеться тим менше, чим більше додано розчинного антигену (Рис. 6Б.)

Для визначення антигену поширений також так званий сендвіч-метод, коли перші антитіла сорбують на пластик, додають пробу, що містить антиген, а потім антитіла до іншої антигенної детермінанти антигену, що також зв’язуються з ним. Ці антитіла можуть бути міченими сами по собі або бути проявленими другими міченими антитілами (Рис. 6В). Кількість зв’язаних “верхніх” антитіл пропорційна кількості антигену в пробі.

Використання других антитіл має своєю метою підсилення кінцевого сигналу, що реєструється в імуноферментному аналізі, і, відповідно, підвищення чутливості методу, оскільки з однією молекулою перших антитіл може зв’язатися декілька молекул мічених других антитіл. Якщо використання других антитіл за якихось причин є небажаним, використовують інші ампліфікаційні системи, наприклад, білки А і G або дуже популярну зараз комплементарну пару авідин-біотин.

Авідин – білок курячого яйця, який має властивість міцно зв’язувати вітамін Н (біотин). Використовують також стрептавідин, який видобувають із стрептококків. Біотин легко приєднати до антитіл, а виявити його наявність можна за допомогою міченого авідину (стрептавідину). Метод можна ускладнити, додавши ще один крок: біотинільовані антитіла, стрептавідин, біотинільована пероксидаза. Чим більше кроків, тим сильніше ампліфікація сигналу, але й тим більше потенційних ускладнень. В цілому, імуноферментні методи менш чутливі, ніж радіоімунні, але у кращих зразках вдавалося досягти порівняної чутливості, особливо при використанні субстратів, що флуоресцують або мають хемілюмінесценцію. Зараз існує широкий вибір комерційних продуктів, що дозволяють виконувати будь-який варіант аналізу. Розроблене спеціальне обладнання для швидкої обробки великої кількості проб, багато процесів автоматизовано.

Принцип сорбційного ІФА використовується не тільки у вигляді ELISA. Замість полістирольного планшету може бути використано іншу тверду фазу, наприклад нітроцелюлозу, яка теж неспецифічно зв’язує білки. Метод у такому випадку називається імуно-дот (від англійського dot - плямка). Використання нітроцелюлози як носія дозволило поєднати імунохімічні методи із електрофорезом – у вигляді так званого імуноблоту (Western blot). В такому випадку антиген розділяють на фракції електрофорезом в поліакриламідному гелі, білки переносять на нітроцелюлозу шляхом простої дифузії або електропереносу, а потім їх проявляють антитілами за тими ж принципами, що і в ELISA. Відміною є те, що в разі імуноблоту використовують інші хромогенні субстрати – ті, що дають нерозчинний продукт, який залишається зв’язаним із нітроцелюлозою.

Як тверду фазу можна використати кульки латексу, на які сорбують антиген чи антитіла. І, нарешті, такі ж підходи використовують, коли антиген природно зв’язаний із твердою фазою: на поверхні чи всередині клітин. На такому принципі побудовані методи імуноцитохімії та проточної цитофлюориметрії.

Якщо антиген міститься на поверхні клітин, їх обробляють антитілами на холоді або після фіксації параформальдегідом. Другі антитіла (або авідин чи білок А) можуть бути міченими ферментом (тоді їх спостерігають під мікроскопом за появою забарвлення), радіоактивною міткою (тоді кількість зв’язаних антитіл міряють лічильником) або флюорохромом. В останньому випадку клітини можна аналізувати просто під флуоресцентним мікроскопом, або методом проточної цитофлюориметрії. Пристрій, створений для такого виду аналізу, називається цитофлюориметр. Він має у своєму складі лазер, у промені якого клітини і розділяються на ті, що світяться, і ті, що ні. Їх можна навіть відсортувати на окремі популяції. Можна також помітити клітини одразу двома чи трьома ( в останніх варіантах навіть чотирма) різними антитілами, зв’язаними із різними флюорохромами. Як правило, вони збуджуються світлом однієї довжини хвилі, а випромінюють у різних діапазонах. Так можна визначати експресію на клітині відразу декількох антигенів.

Для того, щоб визначити, які антигени є у клітини всередині, її треба зробити прониклою для антитіл (як правило, антитіла всередину клітини самі не проникають). Для цього клітини фіксують сумішшю, що містить етанол. Саме так можна побачити під мікроскопом плазматичні клітини, наповнені антитілами.

Щоб ідентифікувати клітини, які секретують антитіла, використовують модифікацію ELISA, що отримала назву ELISPOT. В цьому методі клітини витримують на нітроцелюлозних фільтрах, вкритих антигеном. Секретовані антитіла зв’язуються із антигеном навкруги клітини і після проявлення другими антитілами і субстратом проявляються як кола або плями. Цей метод з’явився як спрощений варіант методу локального гемолізу у гелі, який був дуже поширений ще десять років тому. У тому варіанті клітини вносили в агаровий гель, що містив еритроцити (самі по собі або модифіковані антигеном). Антитіла, що було секретовано, зв’язувалися із еритроцитами, і після обробки комплементом у цих місцях утворювалися зони гемоліза еритроцитів – світлі плями на червоному тлі геля. (Саме таким методом було знайдено гібридоми, що секретували специфічні антитіла, в експерименті Кьолера). ELISPOT теж можна проводити в агарі в лунках полістирольних планшетів.

Таким чином, принцип імунохімічного аналізу антигенів і антитіл має багато модифікацій і може бути використаний для вирішення багатьох експериментальних та діагностичних завдань. Для кожного конкретного завдання підбирають підходящу модифікацію, виходячи із потреб чутливості і можливостей ідентифікації кінцевого продукту.

Лекція 6.

Головний комплекс гістосумісності. Процесинг і представлення антигену.

Нобелівську премію 1980 року по фізіології та медицині одержали Баруй Бенацерраф, Жан Доссе і Джонатан Снелл ”за відкриття, пов’язані з генетично детермінованими структурами на клітинній поверхні, що регулюють імунні реакції”.

У 60-х роках Б.Бенацерраф помітив, що при імунізації одним і тим самим антигеном тварини навіть в межах однієї популяції відповідають по-різному: одні реагують синтезом антитіл, а інші – ні. Було знайдено генетичну основу цього явища і гени, які визначали, чи буде розвиватися імунна відповідь, отримали назву IR (immune response) генів. У 1965 році Хью Макдевіт визначив гени головного комплексу гістосумісності і їх продукти, які вперше було описано Дж. Снеллом як трансплантаційні антигени. І, нарешті, Жан Доссе знайшов такий самий комплекс генів у людини.

Далі було з’ясовано, що гени головного комплексу гістосумісності (main histocompatibility complex, MHC) діляться на два класи: МНС І – це гени трансплантаційних антигенів, а МНС ІІ – це гени імунної відповіді. Їх стали називати ще Ia (immune associated) генами. Виявилося, що продукти цих генів необхідні для представлення антигенів в процесі імунного розпізнання і визначають так званий феномен генетичної рестрикції імунної відповіді. Він полягає в тому, що клітини, які розпізнають антиген (Т лімфоцити) і клітини, що його представляють (макрофаги, дендритні клітини, клітини-мішені у випадку цитотоксичної відповіді) повинні бути генетично однаковими, тобто походити із одного організму або із тварин однієї генетичної лінії. Інакше кажучи, Т лімфоцити розпізнають антиген тільки у комплексі з продуктами сингенних МНС.

У 80-х роках було проведено рентген-структурний аналіз білків МНС І і ІІ, з’ясовано механізми їх біосинтезу та функціонування.

Будова генів МНС та їх продуктів.

Найбільш вивченими є гени МНС миші і людини.

У миші комплекс генів МНС називається Н-2 і в нього входять локуси К, D, L (МНС І) і А і Е (МНС ІІ). У людини цей комплекс називається HLA і до нього входять, відповідно, локуси A, B, C (MHC I) і DP, DQ, DR (MHC II). Серед генів МНС ІІ знаходяться також гени DM-A, DM-B, LMP і TAP, які кодують продукти, важливі для процесингу та представлення антигенів. Гени, що кодують С2, С4 і фактор В системи комплементу, теж розташовані у комплексі МНС і позначаються як МНС ІІІ.

Гени МНС характеризуються полігенністю та поліморфністю. Полігенність полягає в тому, що для кожного класу (І і ІІ) існує декілька локусів (А, В, С або DP, DQ, DR), що сприяє ефективному представленню різних по структурі антигенів у кожного індивідуума. Поліморфність генів МНС у тому, що існує багато їх варіантів (алелей), продукти яких відрізняються до 35% амінокислотного складу, що підвищує вірогідність виживання при зустрічі із певним патогеном на рівні популяції. Поліморфність досягається за рахунок точкових мутацій, рекомбінацій, гомологічного кросинговера та конверсії генів. На відміну від генів імуноглобулінів, гени МНС не підлягають алельному виключенню, тобто у кожного гетерозіготного організму експресуються всі можливі алелі МНС.

Кожний із локусів генів МНС І кодує один поліпептидний ланцюг - a-ланцюг. Кожний із локусів генів МНС ІІ кодує два поліпептидні ланцюги: a і b. Іх позначають як DP_a, DP_b ; DQ_a, DQ_b ; DR_a, DR_b у людини і, відповідно, як A_a, A_b; E_a, E_b у миші. У гетерозиготи кожний ланцюг представлений двома алелями, тобто можливі чотири варіанти білків МНС ІІ кожного локусу (для DR – вісім варіантів, оскільки існують два гени b-ланцюга) і кожна клітина, таким чином, несе на своїй поверхні 16 варіантів білків МНС ІІ. E_a, DP_a, і DR_a є менш поліморфними, ніж гени інших локусів.

Як бачимо, полігенність МНС деякою мірою подібна до полігенності імуноглобулінів, але різноманіття імуноглобулінів і білків МНС досягається різними шляхами: у імуноглобулінів - за рахунок комбінацій генів мультигенної системи, а у МНС – за рахунок наявності різних алельних варіантів у кожному локусі. Різноманіття імуноглобулінів вище за поліморфізм білків МНС. Незважаючи на це, кожний індивідуум має свій набір генів МНС. Продукти генів МНС І є трансплантаційними антигенами і визначають неможливість пересадки органів чи тканин всередині виду. Захворювання деякими хворобами пов’язане із певними варіантами МНС ІІ (діабет І типу, множинний склероз, міастенія гравіс).

Гени МНС по-різному експресовано в клітинах організму. МНС І експресуються майже в усіх клітинах і тканинах (за винятком деяких, де рівень експресії дуже низький, наприклад, у роговці ока; саме тому цю тканину досить легко трансплантувати). МНС ІІ експресовано лише в деяких клітинах, тих, що можуть представляти антиген в імунній відповіді. Це перш за все макрофаги, дендритні клітини і В лімфоцити. Експресію МНС ІІ знаходять також в активованих Т лімфоцитах людини і в деяких клітинах, що можуть представляти антиген в спеціалізованих тканинах: на астроцитах глії мозку, епітеліальних клітинах і нейтрофілах.

Продукт генів МНС І – це гетеродимер, що складається із важкого (43 КДа) a-ланцюга і b₂-мікроглобуліна (11 КДа), ген якого не входить в комплекс генів МНС. Важкий ланцюг складається із трьох доменів: a₁, a₂, a₃, - трансмембранної ділянки і цитоплазматичного С-кінця (Рис.7А). a₃ домен і b₂-мікроглобулін гомологічні доменам імуноглобулінів, а N-кінцеві a₁ і a₂ домени є поліморфними (тобто саме тут локалізовано амінокислотні заміни, що відрізняють алельні форми білків МНС І).

Продукт генів МНС ІІ – теж гетеродимер, який складається із a і b ланцюгів (34 і 28 КДа, відповідно). Кожен ланцюг має два надклітинні домени з N-кінця, трансмембранну і цитоплазматичну ділянки, і загальна структура нагадує таку для білку МНС І (Рис. 7Б). Поліморфними є a₁ і b₁ домени, а a₂ і b₂ - імуноглобуліноподібні.

Рентген-структурний аналіз білку МНС І було зроблено в 1987 році. Надклітинну частину HLA-A2 було відщеплено папаїном і закристалізовано. За результатами аналізу виявилося, що примембранні домени, a₃ і b₂-мікроглобулін, дуже нагадують імуноглобулінові, а зовнішні - a₁ і a₂ - схожі один до одного і утворюють порожнину на верхівці молекули. Шляхом амінокислотних замін (мутацій) у різних частинах молекули було з’ясовано, що залишки, які взаємодіють із рецептором Т лімфоцитів, розташовані на поверхні молекули МНС І, а ті, що приймають участь у зв’язуванні антигенного пептиду, - знаходяться у порожнині. Порожнина у вигляді замкненої кишені виявилася заповненою антигенним пептидом, який представляє дана молекула МНС (Рис. 8А). Було розраховано, що оптимальна довжина пептиду, який вміщується у кишені, складає 8-9 амінокислотних залишків. У різних алельних форм МНС І форма кишені різна і поліморфні залишки зв’язують відповідно, пептиди різної структури.

Рентген-структурний аналіз білку МНС ІІ було зроблено лише через шість років, у 1993 році. Структура виявилася дуже схожою на МНС І, але було знайдено дві важливі різниці:

1) замість замкненої кишені, де зв’язується антигенний пептид, було виявлено щілину, у якій пептид довжиною 15-16 амінокислотних залишків розміщувався у витягнутому вигляді (Рис. 8Б);

2) на відміну від МНС І, МНС ІІ кристалізувався у вигляді димеру (димер гетеродимеру). Вважають, що димеризація сприяє більшій авідності в утворенні комплексу антигенний пептид – МНС ІІ – Т-клітинний рецептор.

Процесинг і представлення антигену. Дихотомія клітинної і гуморальної відповіді.

Як зазначено вище, Т лімфоцити впізнають антиген тільки у комплексі з білками МНС. В процесі клітинної імунної відповіді (наприклад, для знищення власних клітин, інфікованих вірусом, або трансплантованих алогенних клітин) розпізнається антиген у комплексі з МНС І, а для гуморальної імунної відповіді (антитіла до бактерій і розчинних токсинів) антиген має бути представленим з МНС ІІ. Для того, щоб зв’язатися з білками МНС, білковий антиген розщеплюється до коротких пептидів, (8-9 амінокислотних залишків для МНС І і 12-15 залишків для МНС ІІ). Цей процес називається процесингом антигену.

Як імунна система приймає рішення про представлення антигену з МНС І чи ІІ і, відповідно, про розвиток гуморальної чи клітинної форми відповіді, довго залишалося нез’ясованим. Вважали, що має значення доза антигену, його форма і місце введення в організм. Вирішальний експеримент було поставлено у 1986 році Моррісоном і Брейсіелом. Ними було отримано лінії Т лімфоцитів до вірусу грипу, які впізнавали свій антиген у комплексі з МНС І (ЦТЛ І) або з МНС ІІ (ЦТЛ ІІ). Було знайдено, що ЦТЛ І знищували тільки клітини, заражені живим вірусом, тобто коли вірусні антигени синтезувалися всередині клітини, а ЦТЛ ІІ – і тоді, коли вірус був інактивований, тобто пасивно поглинався клітиною. Було зроблено висновку, що ендогенні(внутрішні) антигени презентуються із МНС І, а екзогенні (зовнішні) – з МНС ІІ.

Ці дані було підтверджено у багатьох наступних роботах. Виникало питання, де відбувається зв’язування антигену із білками МНС. Логічним було запропонувати, що ендогенні антигени зв’язуються із МНС І всередині клітини, а екзогенні з МНС ІІ – назовні. Була навіть ідея, що білки МНС ІІ є первинними акцепторами антигену при імунній відповіді. Однак наприкінці 80-х років з’ясувалося, що вільні білки МНС є вкрай нестабільними і швидко руйнуються, тобто не можуть існувати на поверхні клітини у вільному стані. Всі події по зв’язуванню антигенного пептиду, як для МНС І, так і для МНС ІІ, відбуваються всередині клітини на шляху від біосинтезу білків МНС до їх експресії на мембрані. Існує спеціальна система білків-шаперонів, яка утримує ланцюги МНС І і ІІ всередині клітини до тих пір, поки вони не зв’язали антигенний пептид, і спеціальна система, яка слідкує за тим, щоб вільні молекули МНС не з’явилися на поверхні. Ця система температуро-залежна: якщо знизити температуру культивування клітин до 26 – 28^оС (це можливо, наприклад, якщо молекули МНС штучно експресувати у клітинах дрозофіли), то на поверхні з’являються вільні димери МНС.

Біосинтез білків МНС І (Рис.9).

Альфа-ланцюг МНС І і b₂-микроглобулін синтезуються окремо і поступають в ендоплазматичний ретикулюм (ЕПР). Альфа-ланцюг зв’язаний із шапероном калнексіном. Після зв’язування із b₂-мікроглобуліном комплекс передається на інший шаперон – калретикулін і залишається зв’язаним з ним до приєднання антигенного пептиду. Пептид потрапляє в ЕПР із цитозолу, де він утворюється шляхом процесингу ендогенних антигенів. Це можуть бути продукти деградації власних білків, або вірусні чи бактеріальні антигени, що синтезуються всередині клітини. Деградація відбувається за допомогою так званої протеасоми. Протеасома – це великий мультиферментний комплекс (20S, 700КДа), що складається із 15 субодиниць двох типів, a і b, кожна по 21-31 КДа. Субодиниці організовані у вигляді бочки. Пептид (білок) проходить крізь "бочку" і розщеплюється b субодиницями протеасоми. Транспорт антигенних пептидів із цитоплазми в ЕПР виконують спеціальні трансмембранні білки ТАР (transporter of antigenic peptides). Білки протеасоми кодуються генами LMP2 і LMP7, які знаходяться у комплексі генів МНС разом із геном ТАР, причому гени LMP2 і ТАР мають спільний промотор. Пептиди, транспортовані ТАРом, приєднуються до комплексу a-ланцюг/b₂-мікроглобулін за допомогою білка тапасіну. Слід зазначити, що додатковий протеоліз пептиду може відбуватися і після зв’язування з МНС І. Після цього комплекс МНС І-пептид звільняється з шаперонів і у вигляді везикули мігрує на плазматичну мембрану. По дорозі він проходить комплекс Гольджі, де глікозилюється. Перші гіпотези щодо зв’язування антигенного пептиду визначали місцем зв’язування як раз комплекс Гольджі. Використання спеціального антибіотика брефелдіну А, який блокує вихід білків із ЕПР в Гольджі, показали, що пептид сполучається із МНС І до виходу із ЕПР.

Біосинтез білків МНС ІІ (Рис.10).

В ЕПР синтезуються a і b ланцюги, а також спеціальний і-ланцюг (invariant). І-ланцюг синтезується двома альтернативними формами, 31 і 41 КДа, що є результатом альтернативного сплайсингу РНК. І-ланцюг є аналогом антигенного пептиду. Його функції:

1) закриває порожнину МНС ІІ і не дає змоги зв’язатися там ендогенному пептиду;

2) сприяє звільненню МНС ІІ із шаперонів ЕПР;

3) направляє весь комплекс в ендосому.

Таким чином, МНС ІІ у складі a-, b- і і-ланцюгів виходить із ЕПР, проходить комплекс Гольджі, де глікозилюється, і направляється в ендосомальний компартмент, де і відбувається його зустріч з антигеном.

Екзогенний антиген потрапляє в ендосому шляхом ендоцитозу. Різні типи клітин, що презентують екзогенний антиген, здатні до різних типів ендоцитозу. Макрофаги виконують фагоцитоз, дендритні клітини – макро-піноцитоз, а В-лімфоцити – ендоцитоз, опосередкований специфічними рецепторами, що є найбільш ефективним і специфічним. В усіх випадках антиген потрапляє спочатку у вигинання зовнішньої мембрани, а потім у везикули, вкриті ззовні спеціальним білком клатрином. Везикули рухаються всередину клітини, де зливаються із існуючими компартментами і проходять цілий ряд перетворень: в них включаються протонні насоси і знижується рН; починають працювати протеолітичні ферменти з оптимумом рН у кислому діапазоні – катепсини. Остаточним пунктом перетворення ендосоми є лізосома, де білки розщеплюються до амінокислот. На шляху перетворення утворюється спеціальний компартмент, де антигенний пептид зустрічається із білком МНС ІІ, що мандрує із ЕПР. Цей компартмент так і називають МІІС. Екзогенний антиген в МІІС вже знаходиться у вигляді суміші пептидів. Спочатку вважалося, що і-ланцюг просто дисоціює з a/b димеру під дією кислих рН і його місце займає антигенний пептид. Потім з’ясувалося, що і-ланцюг спочатку сам розщеплюється протеазами, в результаті чого в порожнині МНС ІІ залишається лише невеликий пептид – CLIP (class II-associated immunogenic peptide, фрагмент 81-105). Фактично він і є аналогом антигенного пептиду і своєю ділянкою 92-105 інгибує зв’язування інших пептидів у порожнині МНС ІІ. Процес заміщення CLIP на антигенний пептид відбувається за допомогою спеціального білку – димеру DМ-А і DМ-В (їх гени теж знаходяться у комплексі МНС). Цей білок стабілізує проміжні структури МНС ІІ, що утворюються після відщеплення CLIP і дає змогу зв’язатися пептиду екзогенного антигену, який присутній у тій самій везикулі. Якщо зв’язування антигенного пептиду не відбувається, то a/b димер агрегує і перетравлюється власними протеазами. Треба зазначити, що альтернативні форми і-ланцюга (31 і 41 КД) відрізняються за своєю стійкістю до протеолізу: більш важка форма містить інгібітор катепсину L. Таким чином, різні ділянки і-ланцюга несуть різні сигнали: для тримерізації (163-183), направлення в ендосоми (цитоплазматичний хвіст), зв’язування в порожнині МНС ІІ (92-105), інгібування катепсіну L.