Лекція 1. Загальні уявлення. Місце імунології серед інших наук. 2 страница

Спочатку, як модель, було використано короткі синтетичні пептиди. Виявилося, що лінійні гомополімери амінокислот (типу (Ala-Ala)_n) неімуногенні, але після кон’югації з білком-носієм поводять себе як гаптени, тобто мають антигенну специфічність. Розгілковані гетерополімери амінокислот високоімуногенні і викликають синтез антитіл до поверхневих ділянок молекули. Пептиди, взяті у впорядкованій або денатурованій формі, мали різну антигенну специфічність. Якщо синтетичний антиген ніс заряджені групи, то антитіла до нього мали протилежний заряд.

Було зроблено висновків, що антигенні детермінанти знаходяться на поверхні молекули, мають певну конформацію і несуть амінокислотні залишки, здатні утворювати нековалентні зв’язки із антитілом.

Головні роботи по антигенній структурі глобулярних білків було проведено в 70-80-ті роки ХХ сторіччя. В результаті їх було з’ясовано, що антигенна детермінанта чи епітоп – це відокремлена область на поверхні білкової молекули. У склад її входять 6-7 амінокислотних залишків. Не було знайдено зв’язків із якимось певними амінокислотними залишками: у склад антигенних детермінант входили ті амінокислоти, що звичайно розташовані на поверхні білка. Виявилося, що кожна антигенна детермінанта описує на поверхні білка лінію завдовжки 23-25Å і має детерміновані N і C кінці.

Розрізняють послідовні (лінійні) та переривчасті(конформаційні) антигенні детермінанти.

Послідовні – визначаються порядком амінокислот. Антитіла до таких епітопів легко взаємодіють із лінійним пептидом такої ж послідовності. У чистому вигляді зустрічаються у фібрилярних білків та пептидів. У глобулярних білків поверхневі послідовні ділянки мають певну конформацію. Антитіла, отримані до пептидів, часто впізнають нативні білки, тобто можуть певним чином пристосовуватися до конформації поверхневих фрагментів.

Переривчасті антигенні детермінанти складаються із амінокислотних залишків, розташованих далеко один від одного у поліпептидному ланцюгу, але зближених за рахунок третинної структури білка, перш за все дисульфідних зв’язків. Такі антигенні детермінанти не можна змоделювати лінійним пептидом.

Не всі амінокислоти, що входять до складу епітопу, мають однакове значення для розпізнання: як правило, специфічність визначається 1-2 залишками (імунодомінантними), а інші відіграють роль у підтримці належної конформації епітопу.

Як приклади, розглянемо антигенну структура міоглобіну кашалота та лізоциму курячого яйця – перших детально вивчених білкових антигенів.

Міоглобін – гемовмісний білок м’язів з молекулярною масою 18 КДа, складається із 153 амінокислотних залишків, не містить дисульфідних зв’язків. В молекулі міоглобіну було визначено п’ять лінійних епітопів: фрагменти 16-21, 56-62, 94-99, 113-119 і 146-151. У їх склад входили гідрофільні полярні амінокислоти.: Lys, Arg, Glu, His.

Лізоцим – фермент, що міститься у секреторних рідинах організму ссавців і у білку пташиних яєць, з молекулярною масою 14 КДа, має чотири дисульфідні зв’язки. У складі лізоциму було визначено три переривчасті антигенні детермінанти, що відповідали фрагментам:

22-34 і 113-116, зближених дисульфідним зв’язком 30-115;

62-68 і 74-96, зближених зв’язками 76-94 і 64-80;

6-13 і 126-129, зближених зв’язком 6-127.

Для вивчення цих антигенних детермінант було запропоновано спеціальний експериментальний підхід – синтез, що імітує поверхню. Так, для імітації переривчастого епітопу залишки, що було ідентифіковано як імунодомінантні, зшивали в єдиний пептид, поєднуючи окремі фрагменти за допомогою гліцинового спейсора:

116 113 114 34 33

Lys Asn Arg Phe Lys

Lys-Asn-Arg-Gly-Phe-Lys

Такий пептид ефективно блокував зв’язування специфічних антитіл із білком, тобто був схожий на природний переривчастий епітоп.

У 80-ті роки стало ясно, що вся поверхня білка може бути антигенною, тобто якщо для імунізації використовувати синтетичні пептиди, то можна отримати антитіла до будь-якої поверхневої ділянки. Однак при імунізації цілим білком антитіла утворювалися тільки до певних ділянок. Використання моноклональних антитіл чітко визначеної специфічності показало, що кожна антигенна детермінанта фактично складається із декількох потенційно антигенних ділянок, що перекриваються. Тепер такі епітопи стали називати більш вдалим терміном імунодомінантні області.

Природно, постало питання, які фактори визначають імунодомінантність.

Виходячи із визнаної функції імунної системи відрізняти “своє” від “чужого”, першим принципом, покладеним в основу імунодомінантності, був принцип чужорідності антигену по відношенню до білків реципієнта. Щоб з’ясувати справедливість цього принципу вивчали серії гомологічних білків, тобто білків, що зустрічаються у багатьох організмів і відрізняються окремими амінокислотними замінами. Ідеальними для таких експериментів виявилися цитохроми с.

Цитохроми с – це гемовмісні білки дихального ланцюга мітохондрій з молекулярною масою 13 КДа, складаються із близько 100 амінокислотних залишків. Вони з’явились дуже рано в еволюції живого світу, перші цитохроми с зустрічаються у бактерій. Структура білка виявилася настільки вдалою, що зберіглася у принципі до вищих тварин. Цитохроми ссавців відрізняються між собою окремими амінокислотними залишками, тобто можуть бути розглянуті як точкові мутанти. Було знайдено прямий зв’язок між імуногенністю цитохрому с та кількістю залишків, що відрізняли антиген від гомологічного цитохрому с реципієнта. Але стосовно специфічності антитіл, що вироблялися, цей зв’язок не виявився абсолютним. Так, кролі, імунізовані власним цитохромом, модифікованим глютаровим альдегідом, виробляли антитіла проти епітопів власного цитохрому. Коли тварин різних видів імунізували одним типом цитохрому, то антитіла вироблялися проти одних і тих самих ділянок. Тоді стали розглядати інший принцип імунодомінантності – зв’язок із структурними особливостями антигену: доступністю, зарядом, специфічним розташуванням на згині подіпептидного ланцюга. Було запропоновано алгоритми пошуку імунодомінантних ділянок за принципами гідрофільності та атомної рухливості. Подальші експерименти виявили зв’язок гідрофільності і рухомості із еволюційною варіабільністю: амінокислотні заміни, що закріпилися в еволюції, не повинні порушувати біологічні функції цитохрому с і тому локалізувалися саме у поверхневих, найбільш гнучких ділянках, де поява іншої амінокислоти найбільш безпечна і може бути компенсована за рахунок гнучкості молекули.

В результаті цих досліджень було дійдено висновку, що хоча вся поверхня білка в принципі може бути антигенною, за природної імунізації нативним білком антитіла утворюються тільки до певних епітопів, імунодомінантність яких визначається їх структурними особливостями, перш за все, гідрофільністю і атомною рухомістю (гнучкостю).

Антитіла (і В лімфоцити) зв’язують нативний антиген і впізнають на його поверхні так звані В-епітопи. Але ж у процесі імунної відповіді антиген впізнається і Т лімфоцитами. Більше того, саме специфічність Т лімфоцитів визначає ті імунодомінантні ділянки, що буде впізнано як В-епітопи. Ділянки антигену, що розпізнаються Т лімфоцитами, називаються Т-епітопами. Їх положення і структура визначаються не так легко, як для В епітопів, тому що Т клітини впізнають антигени зовсім по-іншому.

1. Для розпізнання Т лімфоцитами антиген має бути процесованим (розщепленим). Процесинг відбувається всередині спеціалізованих клітин під дією протеолітичних ферментів. Спектр пептидів, що утворюються, залежить від типу протеаз, які відрізняються у різних типів клітин.

2. Процесований пептид має бути представленим у комплексі із білками головного комплексу гістосумісності: відбір антигенного пептиду залежить від структури цих білків, які є високо поліморфними і відрізняються навіть у різних особистостей одного виду.

3. Розпізнання представленого пептиду залежить від репертуару Т-клітинних рецепторів, який є результатом позитивного та негативного відбору у певного індивіда.

В результаті, Т–епітоп – це не обов’язково поверхнева структура; не конформаційно-залежний, а лінійний пептид. Його положення не пов’язане із гідрофільністю чи рухомістю поліпептидного ланцюга. Воно залежить як від структури нативного білка (потенційні сайти протеолізу, пептидні мотиви, що відповідають сайтам зв’язування білків гістосумісності), так і від стану імунної системи індивідуального реципієнта (репертуар білків гістосумісності і Т-клітинних рецепторів). Т-епітопи більше пов’язані із сайтами чужорідності антигену по відношенню до білків реципієнта, ніж В-епітопи, оскільки репертуар Т-рецепторів проходить більш суворий негативний відбір.

Визначення будови і локалізації В і Т епітопів представляє не тільки фундаментальний інтерес. Воно необхідне для створення ефективних вакцин і імунодіагностикумів.

Резюме.

Імунна система здатна впізнати майже будь-яку речовину із середовища, що оточує макроорганізм. Для цього антиген має бути належним чином представлений імунним клітинам. В лімфоцити і антитіла впізнають конформаційно-залежні поверхневі епітопи, розташовані у місцях найбільшої гідрофільності та гнучкості поліпептидного ланцюга. Т лімфоцити впізнають внутрішні лінійні пептидні фрагменти, які утворюються в результаті протеолізу (процесингу) нативного антигену.

Лекція 3. Антитіла, їх будова і властивості.

Наприкінці минулого століття Е. фон Берінг винайшов антитіла (антитоксини) до токсинів дифтерії та правцю і показав, що імунітет може бути перенесений гуморальним шляхом. П. Ерліх вперше довів, що антитіла можна отримати не тільки до збудників хвороб, а й до суто хімічних речовин, ріцину та абрину (отрути рослинного походження). М. Пфайфер знайшов, що антитіла мають властивості до переведення речовини антигену із розчинного у нерозчинний стан: аглютинації та преципітації.

Природу антитіл було визначено тільки в середині ХХ століття. У 1937 році Ян Тізеліус провів електрофорез білків сироватки крові, визначивши (від + до -) альбумін, альфа1-, альфа2-, бета- та гамма-глобуліни. Через 22 роки Кебот знайшов, що після імунізації тварини зростає пик гамма-глобулінів в її сироватці, а після виснаження імунної сироватки антигеном він знову знижується. Таким чином було доведено, що антитіла відносяться до гамма-глобулінів. Щоб підкреслити роль антитіл в імунних реакціях, їх стали називати імуноглобулінами.

Вивченню структури антитіл сприяло використання так званих мієломних імуноглобулінів. Мієломи – це злоякісні захворювання, при яких вибірково розмножуються В лімфоцити однієї специфічності, утворюючи клон, і накопичується велика кількість абсолютно однакових моноклональних антитіл (до 70 мг/мл сироватки).

Структуру антитіл було вивчено Едельманом і Портером у 60-х роках, за що вони у 1972 році отримали Нобелівську премію.

Молекула антитіла (Рис.1) складається із двох типів поліпептидних ланцюгів: важких (Н) і легких (L). Важкі ланцюги поділяють на класи : a, m, g, d, e,- і відповідно розрізняють п’ять класів імуноглобулінів: IgA, IgM, IgG, IgD, IgE. Для легких ланцюгів виділяють типи k і l; k зустрічаються частіше, ніж l. У структурі молекули імуноглобуліну по два важких і легких ланцюга. У склад молекули входять однакові половинки, тобто однакові пари ланцюгів: g₂k_2, g₂l_2, a₂k_2, a₂l₂ і так далі. Підкласи важких ланцюгів (у людини): 4g (g1, g2, g3 і g4), 2m (m1 і m2), 2a (a1 і a2), 1e і 1d. Підтипи легких ланцюгів: 1k, 4l ( +l₅, що експресується в ембріональному стані).

Важкий ланцюг складається із 440-450 амінокислотних залишків (m -ланцюг має на 100 залишків більше) і має молекулярну масу близько 50 КДа, а легкий ланцюг складається із 220-230 амінокислотних залишків і має молекулярну масу близько 25 КДа. Ланцюги з’єднані між собою міжланцюговими дисульфідними зв’язками. Їх зосереджено переважно у так званій шарнірній ділянці або “талії” молекули.

Внутрішньоланцюгові дисульфідні зв’язки замикають домени (приблизно по 80 амінокислотних залишків), їх два у легкому ланцюгу і чотири у важкому (п’ять у m -ланцюгу). Домени такої будови зустрічаються у багатьох рецепторних молекулах; їх так і називають – імуноглобуліноподібні домени.

При порівнянні амінокислотних послідовностей десятків мієломних білків було помічено, що відмінності між ними (амінокислотні заміни) розташовані не стохастично по ланцюгу, а локалізовані у перших (N-кінцевих) доменах важкого і легкого ланцюгів. Відповідно, стали розрізняти константні (С) і варіабільні(V) домени. Так, легкий ланцюг складено із одного V і одного С доменів, а важкий – із одного V і трьох (m -ланцюг із чотирьох) С доменів. Їх позначають відповідно V_L, V_H, C_L, і C_H. З одним набіром С-доменів може бути об’єднано багато V-доменів. Клас імуноглобулінів визначається саме С доменом, тобто один V-домен може бути в складі як IgМ, так і IgА, а імуноглобуліни одного класу можуть мати широкий спектр V-доменів..

У складі V-доменів виділяють так звані гіперваріабільні ділянки, де заміни зустрічаються частіше за інші. Їх іще називають CDRs (complementarity determining regions), тобто ділянки, що визначають комплементарність зв’язування з антигеном. Саме ці ділянки входять до складу активного центру антитіла. Їх по три у важкому і легкому ланцюгах. Ділянки між ними – каркасні, що є менш еволюційно варіабільними і визначають взаємне розташування CDRs. Завдяки симетричній структурі імуноглобуліну, кожна молекула антитіла має два центри зв’язування з антигеном: у V-доменах важких і легких ланцюгів кожної пари.

Фрагменти імуноглобулінів.

Шляхом протеолізу можна отримати фрагменти імуноглобулінів, частина з яких зберігає здатність зв’язуватися з антигеном (Рис.2). Саме шляхом вивчення таких фрагментів було встановлено структуру антитіл. Найбільш чутливою до протеолізу є шарнірна ділянка завдяки наявності великої кількості залишків цистеїну та проліну, що забезпечують гнучкість поліпептидних ланцюгів і доступність до дії протеолітичних ферментів. Саме завдяки гнучкості шарнірної ділянки, молекула імуноглобуліну може змінювати кут між двома гілками, що містять центри зв’язування антигену.

Папаїн розщеплює молекулу імуноглобуліну вище шарнірної ділянки на 2Fab (Fragment antigen-binding) + Fc (Fragment cristallizable, constant) фрагменти. Fab (по 50 КДа) зберігають властивість зв’язуватися з антигеном, оскільки містять варіабільні домени важкого та легкого ланцюгів, і є моновалентними. Fc (50 КДа) не зв’язує антиген і несе властивості, характерні для даного класу імуноглобулінів. За допомогою плазміну Fab фрагмент може бути далі розщеплений на Fv і Fd фрагменти, по 25 КДа кожний.

Пепсин розщеплює молекулу імуноглобуліну нижче шарнірної ділянки, в результаті чого утворюється двохвалентний F(ab’)₂ і pFc’ фрагменти із вагою 100 і 25 КДа, відповідно.

Шляхом відновлення дисульфідних зв’язків (наприклад, за допомогою 2-меркаптоетанолу) молекулу імуноглобуліну можна розібрати спочатку на дві половинки по 75 КДа, а потім – на важкі та легкі ланцюги. Половинки повністю, а важкі ланцюги частково, зберігають здатність зв’язуватися з антигеном.

Імуноглобуліни – глікопротеїди, містять до 12% вуглеводів (IgG – 2-3%), манози та галактози, що приєднуються до С_Н2 домену за залишки Asp, через N-ацетилглюкозамін.

Вторинна структура імуноглобулінів – переважно антипаралельна b -складка, спіралізованих ділянок майже нема. У третинній структурі треба зазначити виражену доменну будову, гнучкість Fab фрагментів відносно осі молекули та специфічну будову центру, що зв’язує антиген, про що мова піде окремо.

Деякі класи імуноглобулінів утворюють олігомерні форми. Так, IgA утворюють димери, а IgM –пентамери. Пентамер утворюється за рахунок дисульфідних зв’язків між окремими молекулами IgM, крім того додається J-ланцюг (12 КДа), який циклізує весь олігомер у вигляді зірки. IgG, IgD, IgE зустрічаються тільки у вигляді мономерів. Молекулярна вага їх складає відповідно 150 КДа, а пентамеру IgM – 890-900 КДа.

Імуноглобуліни теж можна розглядати як антигени. На них відрізняють три типи антигенних детермінант: ізотипічні, алотипічні та ідіотипічні. Ізотипічні антигенні детермінанти локалізовані на Fc фрагментах важких ланцюгів і фактично є характеристиками типів і підтипів важких ланцюгів. Алотипічні детермінанти обумовлені існуванням алельних форм (алельних генів одного локусу) імуноглобулінів і притаманні генетично різним особистостям одного виду. У білковій структурі вони визначаються як заміни 1-2 амінокислотних залишків. Так, на g -ланцюгах людини відомо 25 алотипічних маркерів, на k-ланцюзі їх три. На відміну від ізо- та ало-детермінант, ідіотипічні детермінанти зв’язані із Fab фрагментами антитіл, точніше із їх активним центром. Фактично, ідіотип визначає специфічність антитіла, він є індивідуальним для кожної молекули і до його складу входять амінокислотні залишки гіперваріабільних ділянок.

Ізо-, ало- та ідіотип-специфічні антитіла можна отримати штучно і використовувати для ідентифікації відповідних детермінант на молекулі імуноглобуліну. Не можна виключити, що такі антитіла утворюються і природно. Особливо це стосується анти-ідіотипічних антитіл, які можуть утворюватися при появі великої кількості антитіл певної специфічності в результаті імунізації. Суто логічний ланцюг утворення анти-ідіотипв і анти-анти-ідіотипів послужив основою для створення теорії ідіотипічних мереж (Н.Йєрне). Згідно до цієї теорії, анти-ідіотипічні антитіла та відповідні клітини такої специфічності є потужним фактором регуляції імунної відповіді. Ця теорія була дуже популярною у 70-80-х роках, але експериментального підтвердження не знайшла і фактично у сучасній літературі не обговорюється.

Молекулу імуноглобуліну побудовано таким чином, що різні її ділянки відповідають за різні функції. Так, функцією Fab-фрагменту є утворення центру, що зв’язує антиген. Біологічний ефект зв’язування антигену, тобто наслідок його імунного розпізнання, залежить від природи Fc-фрагменту. Це можуть бути зв’язування з Fc-рецепторами, які існують на поверхні багатьох клітин, фіксація комплементу та деякі інші, так звані ефекторні функції. Різні класи імуноглобулінів мають різні структури Fc фрагментів і, відповідно, можуть виконувати різні функції.

Функції різних класів імуноглобулінів.

IgM

Таку будову мають антиген-специфічні рецептори В клітин. На мембрані В клітин IgM знаходиться у вигляді мономеру із додатковим гідрофобним доменом. Після активації В лімфоцити спочатку секретують пентамерний IgM, а потім переключаються на IgG або інші класи імуноглобулінів. Таким чином, IgM є першим бар’єром на шляху інфекції. Він має невисоку специфічність (спорідненість) до антигену, але завдяки своїй пентамерній формі може одночасно зв’язати п’ять молекул антигену, що в сумі дає високу авідність зв’язування. Також завдяки олігомерності легко викликає аглютинацію (злипання) мікробіальних клітин, що сприяє їх знищенню макрофагами. Так звані ”нормальні” антитіла, присутні в крові здорових індивідів, теж є здебільшого IgM. Еволюційно цей клас з’явився раніше, ніж інші класи імуноглобулінів.

IgG

Це головний клас сироваткових антитіл при вторинній імунній відповіді. Проходить крізь плаценту, тому у перші тижні життя IgG матері є головним засобом захисту новонародженого від інфекцій. Міститься також у молозиві. Має велике значення для опсонізації бактеріальних токсинів і мікроорганізмів. Опсонізація – утворення імунних комплексів, що сприяє знищенню антигену неімунними клітинами. Здійснюється за рахунок зв’язування комплексу: 1) з Fc-рецепторами на макрофагах і природних кілерах чи 2) з компонентами комплементу. Зв’язування антигену призводить до зміни конформації Fc фрагменту, що значно збільшує здатність до 1) і 2) у порівнянні з вільними антитілами.

Підкласи IgG відрізняються за своїми властивостями: здатністю до спонтанної агрегації, зв’язуванню комплементу. Їх біосинтез регулюється різними механізмами, за участю різних типів Т клітин. Інколи присутність певного підкласу IgG має критичне значення. Наприклад, при аутоімунній пузирчатці утворюються аутоантитіла до одного із білків шкіри, десмоглеїну 3. У здорових людей і у хворих в стані ремісії знаходять антитіла підкласу IgG1. Коли хвороба загострюється і починає вражати шкіру і слизові оболонки, у хворих знаходять антитіла IgG1 та IgG4. Таким чином, патогенними є IgG4, а не IgG1.

З усіх імуноглобулінів, присутніх в сироватці крові, концентрація IgG є найбільшою, у неімунізованої тварини – близько 10 мг/мл (5х10¹⁶ молекул). Для порівняння, концентрація IgM у сироватці складає 0,1мг/мл.

IgA

Міститься переважно у секретах слизових оболонок: слині, сльозах, соплях, поті, молозиві, секретах легенів, шлунково-кишкового тракту та сечо-статевих органів. Існує у вигляді димеру, поєднаного J-ланцюгом (15 КДа). Захищений від протеолізу за рахунок комплексу із так званим секреторним компонентом (60 КДа). Секреторний компонент – це частина рецептору до IgA на епітеліальній клітині, через яку IgA проходить із кровоносної чи лімфоїдної судини до слизових оболонок. Вона інтерналізується разом із IgA, а потім екзоцитуться у секрет.

У сироватці крові IgA присутній у мономерній формі. Відомі два підкласи IgA: IgA1 (80-90%) та IgA2, у якого немає дисульфідних зв’язків між важкими і легкими ланцюгами.

IgE

Міститься у сироватці крові, концентрація невелика. Основна функція – індукція гострої реакції запалення шляхом звільнення медіаторів запалення: вазоактивних амінів - гістаміну та серотоніну - із тучних клітин. Цей процес запускається після взаємодії IgE з антигеном. В нормі медіатори запалення викликають приток у місце інфекції IgG антитіл, комплементу, нейтрофілів, еозинофілів, що сприяє подоланню інфекції. Однак у цьому цілком нормальному механізмі часто трапляється збій, і тоді організм починає раптово відповідати надто сильно, неадекватно, на якийсь незначний і не небезпечний антиген типу пилку рослин чи бджолиної отрути. Тоді виникає алергічна реакція: анафілактичний шок, сінна лихоманка, бронхіальна астма. IgE – головні медіатори алергії.

IgD

Існують тільки у мембранозв’язаній формі у вигляді рецепторів В лімфоцитів. При розвитку В клітин з’являються після IgM. Якісь особливі функції невідомі.

Будова активного центру антитіл.

Будову активного центру антитіл вивчали різними методами.

1. Фотоафінна та спінова мітка. Принцип: до антигену вводили хімічну групу, яка під дією опромінення утворювала ковалентні зв’язки із амінокислотними залишками, що її оточують. Потім комплекс антиген-антитіло гідролізували і визначали, із якою саме амінокислотою зв’язана мітка. Таким чином було знайдено, що у склад активного центру антитіла входять гіперваріабільні амінокислотні залишки.

2. Було помічено, що зв’язок антиген-антитіло руйнується при зміні рН, іонної сили і при додаванні органічних розчинників чи хаотропних іонів. Так було зроблено висновку, що зв’язок антигену з антитілом не ковалентний, а іонний, водневий чи гідрофобний.

3. Розміри активного центру вивчали за допомогою олігомерів амінокислот і вуглеводів різного розміру. Так було знайдено, що в активному центрі антитіла може поміститися 5-6 залишків амінокислот чи глюкози і розміри активного центру становлять, відповідно, біля 15х6х8 Å (12х20 Å) і можуть варіювати у різних антитіл.

4. Те, що активний центр – це порожнина, заглиблена у Fv фрагмент, було знайдено за допомогою бівалентного гаптена (два дінітрофенола, розділених різною кількістю метиленових радикалів). При додаванні антитіл до такого антигену під електронним мікроскопом спостерігали характерні кільцеві структури, утворені збігом декількох молекул антитіл, що зв’язали антиген. Такі структури не утворювалися, якщо довжина спейсора була менше за 5(СН₂), тобто активний центр був заглиблений у Fv фрагмент приблизно на 15 Å.

5. І, нарешті, у 70-ті роки було зроблено рентген-структурний аналіз мієломних імуноглобулінів, який підтвердив дані, отримані раніше, і показав, що активний центр антитіла – це порожнина, в утворенні якої приймають участь гіперваріабельні ділянки Fab фрагменту, зближені у третинній структурі.

Чому антиген зв’язується саме в активному центрі, а не зовні, хоча цілком можливі такі ж самі комбінації амінокислотних залишків на поверхні білкової молекули? Це питання стосується також активних центрів ферментів. Роботами Річардса (1974) було показано, що атомна густина у центрі зв’язування ферментом субстрату значно менша, ніж в інших частинах молекули: хімічні групи можуть рухатися з більшою кількістю ступенів волі. Таку ж закономірність було знайдено і для активних центрів антитіл. Прийнявши до уваги, що підвищена атомна мобільність є також ознакою В епітопів, можна дійти висновку, що спорідненість одна до одної мають саме найбільш гнучкі, рухомі ділянки. Зв’язок призводить до взаємної стабілізації, тобто є енергетично вигідним (іде із зменшенням вільної енергії). Комплекс, що утворився, є більш стабільним, ніж його компоненти. Це підтверджено експериментально: антитіла у комплексі з антигеном потребують для денатурації вдвічі більше гуанідінхлориду, ніж тіж самі антитіла у вільній формі.

У 70-ті роки було проведено моделювання активного центру антитіл шляхом синтезу, що імітує поверхню. Так, по даним рентген-структурного аналізу, в утворенні активного центру антитіла до фосфорилхоліну (мієломного IgМ-603) приймали участь такі амінокислотні залишки:

61Н…..60Н…..52Н……33Н……35Н……36Н…….37Н

Ser Tyr Arg Tyr Glu Trp Val

Було синтезовано пептид, який містив ці залишки, поєднані гліциновими спейсорами: Ser-Tyr-(Gly)₂- Arg-Tyr-Gly-Glu-Trp-Val. Cинтетичний пептид зв’язувався із фосфорилхоліном і конкурував із природними антитілами.

Далі такий підхід було використано для моделювання активного центру білок-специфічних антитіл, зокрема до епітопу лізоциму:

116 113 114 34 33

Lys Asn Arg Phe Lys

Lys-Asn-Arg-Gly-Phe-Lys - синтетичний пептид

Asp-Gln-Asp-Gly-Leu-Asp - комплементарний пептид

Комплементарний пептид зв’язувався з лізоцимом і конкурував із специфічними антитілами. Це не означало, що пептид повністю співпадає із будовою активного центру, але він був побудований за тим самим принципом.

Таким чином, стало зрозумілим, що основа високої специфічності антитіл полягає у відповідному розташуванні амінокислотних залишків в активному центрі; зміна заряда чи розмірів антигенної детермінанти зменшує ефективність зв’язування.

При подальшому вивченні мієломних білків було з’ясовано, що активний центр не є моноспецифічним: в одному активному центрі можуть зв’язуватися структурно різні антигени. Вперше це було показано на білку МОРС 450, який крім дінітрофенолу зв’язував структурно несхожий менадіон. При вивченні широкого спектру неспоріднених гаптенів було з’ясовано, що вірогідність їх зв’язування в одному активному центрі сягає 1 на 140. Вони зв’язуються у різних ділянках порожнини активного центру, яка є досить великою для декількох варіантів зв’язування гаптену.

Таким чином було доведено, що обмежений репертуар антитіл може зв’язувати велику, практично необмежену кількість антигенів. Тоді універсальний характер імунної відповіді потребує кінцевого (10⁴-10⁶) репертуару варіантів антитіл.

Висока вірогідність зв’язування структурно різних антигенів однією молекулою антитіла ставила питання про основу високої специфічності імунної відповіді в цілому: чому при специфічній відповіді не вражаються власні або інші неспоріднені антигени? Відповіддю на це стало визначення високої гетерогенності антитіл. Імунізація певним антигеном призводить до появи великої кількості варіантів антитіл. Кожне із цих антитіл, крім даного антигену, може впізнати декілька інших, але доля його серед загальної суміші невелика і тому вірогідність ефективного розпізнання неспоріднених антигенів низька. З іншого боку, спільним для всіх варіантів вироблених антитіл є те, що вони впізнають один антиген. Тому вірогідність його ефективного зв'язування дуже велика. Таким чином, специфічність імунної відповіді є інтегральною величиною, яка складається із багатьох долей різних антитіл, кожне з яких є поліфункціональним. Чим більше клонів В клітин стимульовано, тим більша доля антитіл до певного антигену і менша – до інших неспоріднених антигенів. Це означає, що специфічність імунної відповіді є по суті популяційним явищем, а не властивістю кожного члену популяції. Інтегральна специфічність реалізується за рахунок гетерогенності антитіл.

Резюме.

Антитіла за своєю природою є імуноглобулінами. Вони мають симетричну будову молекули, яка складається із двох типів ланцюгів: важкого і легкого. Ділянки ланцюгів замкнено в домени, які фактично є одиницями структури цих білків. Розрізняють варіабільні і константні домени. Варіабільні утворюють активний центр антитіла, що відповідає за зв’язування антигену. Константні домени відповідають за ефекторні функції антитіл: преципітацію токсинів і аглютинацію бактерій, опсонізацію, активацію комплементу, дегрануляцію тучних клітин. Активний центр антитіла – це порожнина, заглиблена в Fv-фрагмент, яка може зв’язувати структурно різні антигени.