АЛКАЛОИДЫ, ПРОИЗВОДНЫЕ ИЗОХИНОЛИНА 3 страница

Объекты для исследования:

1. Промывные воды желудка (если токсикант был принят внутрь, то промывные воды будут содержать его следы);

2. Желудок с содержимым, кишечник с содержимым (обнаруживаются остатки токсиканта, не успевшие всосаться в кровь);

3. Части печени, почек (аминазин метаболизируется в печени, частично выводится почками).

Аминазин относится к группе веществ, изолируемых подкисленным спиртом или подкисленной водой. Изолирование аминазина и его метаболитов рекомендуется производить спиртом, подкисленным до рН 2,0 - 3,0 10% раствором щавелевой кислоты, с последующей экстракцией основания эфиром при рН 13,0 и реэкстракцией вещества в 0,5 н раствор серной кислоты (изолирование по Е.М. Саломатину). Аминазин является соединением со слабыми основными свойствами, так как содержит в структуре третичный атом азота и при подкислении переходит в хорошо растворимую в воде и спирте ионизированную форму:

- при последующем повышении pH до 13,0 солевая форма переходит обратно в неионизированную форму, которая легко экстрагируется в эфир.

- при последующей реэкстракции раствором серной кислоты снова образуется протонированная форма аминазина.

Таким образом, за счет многократной реэкстракции происходит выделение анализируемого вещества и очистка от примесей.

Аналогично протекает извлечение из биологического материала основного метаболита аминазина – его сульфоксидного производного:

Также изолирование производных фенотиазина можно проводить путем экстракции из биологического материала подкисленной водой с последующей экстракцией органическим растворителем (диэтиловый эфир, хлороформ) из этого раствора, подщелоченного с помощью 25% раствора аммиака.

Предварительные испытания. В качестве предварительных испытаний на аминазин могут быть рекомендованы качественные реакции:

• С растворами йодида висмута в йодиде калия и фосфорно-молибденовой кислоты производные фенотиазина дают аморфные осадки

• С концентрированной серной кислотой возникает устойчивое пурпурно-красное окрашивание

• С формалином и серной кислотой производные фенотиазина дают пурпурно-красное окрашивание, усиливающееся при стоянии

• С концентрированной азотной кислотой возникает пурпурно-красное окрашивание (образование сульфоксида), которое быстро исчезает (образование сульфона).

• С 5% раствором золотохлористо-водородной кислоты аминазин (после 3-4 кратной обработки основания 0,1 М. раствором HCl) выделяется темно-красный аморфный осадок, переходящий через 20-50 мин. в характерный кристаллический осадок. Кристаллы в виде палочек и сростков из них, напоминают снопы и сфероиды. Кристаллы оптически активны (погасание косое, угол погасания 20-300, удлинение кристаллов положительное).

• С реактивами Марки и Фреде окраска производных фенотиазина — от красной до фиолетовой.

• С реактивом Манделина тизерцин дает красно-фиолетовую окраску; дипразин дает зеленую, переходящую в пурпурную окраску. Окраска у других производных фенотиазина — от красной до фиолетовой.

ТСХ-обнаружение

Для этого на хроматографическую пластинку стеклянным капилляром наносят каплю исследуемого раствора. Нанесенное пятно подсушивают на воздухе. Рядом наносят растворы известных препаратов, производных фенотиазина («свидетели») и вновь подсушивают пластинку. Затем пластинку вносят в камеру для хроматографии, насыщенную парами растворителя (смесь 25% раствора аммиака и этилового спирта в соотношении 1:1, либо 25% раствора аммиака, этилацетата и ацетона 4:90:45). После хроматографирования в указанных системах растворителей пластинку проявляют 50% раствором серной кислоты в этиловом спирте. Затем пластинку помещают на 3-5 мин в сушильный шкаф, нагретый до 1000С. Измеряют значение Rf проявившихся пятен, сравнивают их с Rf пятен «свидетелей» или со справочными значениями Rf. Аминазину соответствует значение Rf 0,35 во второй из приведенных выше систем растворителей.

5.5.25. ПРОИЗВОДНЫЕ 1.4-БЕНЗОДИАЗЕПИНА

Группа производных 1,4-бензодиазепина представлена разнообразными по структуре соединениями, обладающими широким спектром фармакологической активности и высокой эффективностью. С токсикологической точки зрения эта группа соединений представляет большой интерес для экспертов в связи с широкой распространенностью случаев передозировки. В настоящее время группа производных 1,4-бензодиазепина насчитывает порядка 100 широко распространенных представителей, структура которых весьма разнообразна. Свойства представителей группы напрямую связаны со структурой и весьма различны. В связи со сравнительно небольшой стоимостью, довольно широким спектром действия, высокой эффективностью и менее серьёзными побочными эффектами по сравнению с другими группами транквилизаторов, седативных веществ, нейролептиков производные 1,4-бензодиазепина доступны многим. Число отравлений этой группой веществ, особенно феназепамом, достигает высоких значений, что стимулирует поиск оптимальных методов анализа данной группы лекарственных средств.

1. Структура

Таблица 7. Основные представители производных 1,4-бензодиазепина

2. Физико-химические и химические свойства

Растворимость. Большинство 1,4-бенздиазепинов представляют собой бесцветные, хорошо кристаллизующиеся вещества. Практически нерастворимы в воде, растворимы в воде соли 1,4-бенздиазепинов, содержащих амино- (как у хлордиазепоксида) или карбоксильную группу в качестве заместителей. В органических растворителях растворимость зависит от структуры. Наиболее высокая растворимость наблюдается в диметилформамиде, диметилсульфоксиде.

Липофильность соединений определяется величиной коэффициента распределения (Кр) в системе вода - несмешивающийся в ней растворитель. Коэффициент распределения характеризует способность соединений проникать через биомембраны, а также определяет оптимальные условия экстракции соединений, из водной фазы в органический растворитель. Величины lg Кр производных 1,4-бенздиазепина в системе н-октан-фосфатный буфер (рН 7,4) следующие:

диазепам - 2,93

хлордиазепоксид -2,36

оксазепам - 2,24

нитразепам - 2,16

Ультрафиолетовые спектры

В электронных спектрах производных 1,4-бенздиазепина имеется 3 полосы поглощения с λmax в областях:

1. 200-215 нм

2. 220-240 нм

3. 290-330 нм

Две первые полосы соответствуют возбуждению ароматических хромофоров. Третью длинноволновую полосу относят к азометиновой связи, сопряженной с бензогруппой.

По характеру поглощения в УФ-области 1,4-бенздиазепины относятся к соединениям, абсорбция которых изменяется от величины значений рН:

- в кислой среде – за счет протонирования атома азота 1 (у хлордиазепоксида) и 4 (1,2-дигидропроизводных 1,4-бенздиазепина – нитразепам, оксазепам, диазепам);

- в щелочной среде в молекуле 1,2-дигидропроизводных 1,4-бенздиазепина наблюдается изменение хромофорной системы (увеличение сопряжения за счет лактим-лактамной таутомерии азометиновой связи в положения 1,2 - нитразепам, оксазепам).

Это свойство положено в основу идентификации соединений данной группы по электронным спектрам поглощения.

Кислотно-основные свойства

1,4-бензодиазепины являются слабыми основаниями. Основность соединений данного типа увеличивается при наличии основных заместителей. Так, хлордиазепоксид дает устойчивые соли с сильными кислотами, выступая в качестве однокислотного основания. При введении в ядро 1,4-бенздиазепинов нитро-, окси- и других групп основность соединений снижается.

1,2-дигидропроизводные 1,4-бенздиазепина (оксазепам, нитразепам) проявляют также слабокислые свойства за счет наличия в молекуле амидной группы.

В таблице представлены константы ионизации рКа1 и рКа2, характеризующие соответственно основность атома азота в четвертом положении и кислотность амидной группы (положение 1,2).

Таблица 8. Значение величин рКа производных 1,4-бенздиазепина:

Сопоставление величин рКа1 и рКа2 1,2-дигидропроизводных 1,4-бенздиазепина позволяет отметить передачу эффектов электронных смещений в молекуле. Электродонорные заместители, увеличивающие плотность электронов у атома азота в 4-ом положении, повышают основность, а электроноакцепторные заместители снижают ее. Введение заместителей в положения 3 и 1 снижает основность соединений, в основном, за счет стерического экранирования атома азота в 4-ом положении, затрудняющего его протонизацию. Кислотность амидной группы электроноакцепторные заместители увеличивают, а электронодонорные – уменьшают.

Гидролиз производных 1,4-бенздиазепина катализируется как кислотами, так и щелочами.

Кислотный гидролиз хлордиазепоксида (I), протекающий в мягких условиях, приводит к образованию 4-окси-1,2-дигидро-3Н-1,4-бенздиазепин-2-онов (II). В более жестких условиях эти соединения гидролизуются до 2-аминобензофенонов (III), альфа-аминокислот (IV) и аминов (V).

Процесс кислотного гидролиза 1,2-дигидропроизводных 1,4-бензодиазепина протекает по следующей схеме:

Продуктами гидролиза являются аминобензофеноны (III) и аминохинолоны (IV), образующиеся из промежуточного соединения (II). В процессе щелочного гидролиза 1,2-дигидропроизводных 1,4-бензодиазепина образуются соли аминокислот, которые при взаимодействии с кислотами образуют бензофенон и производные глицина.

3. Фармакокинетика производных 1,4-бензодиазепина.

Механизм всасывания - простая диффузия. Попадая в кровь, они на 80-95% связываются с белками плазмы, поэтому скорость абсорбции достаточно высокая (градиент концентрации направлен в кровь). Максимальная концентрация в крови при введении через рот достигается через 2-5 часов после введения терапевтических доз и через 4-8 часов – токсических доз препаратов. Далее концентрация их в крови сохраняется в течение 2-х часов на одном уровне, после чего начинает медленно снижаться.

Распределение производных 1,4-бензодиазепина по органам происходит в три стадии:

1-ая характеризуется падением концентрации в крови и накоплением в паренхиматозных органах;

на 2-ой стадии идет накопление соединений во всех органах. Предел накопления соединений в тканях определяется кажущимся объемом распределения (Vр);

3-я стадия, самая продолжительная по времени – характеризуется накоплением соединений в органах выделения (печени, почках), с одновременным уменьшением в остальных тканях органов.

Наибольшее содержание 1,4-бензодиазепинов в ЖКТ, тканях печени, почек.

Метаболизм

Попадая в организм, производные 1,4-бензодиазепина подвергаются различным метаболическим превращениям, которые катализируются монооксигеназами печени, локализованными в микросомах.

Окисление

1.1. N-деметилирование

1. В молекуле диазепама у атома азота в 1 положении

1. В метиламинной группе хлордиазепоксида

1.2. Гидроксилирование

Восстановление нитрогруппы в молекуле нитразепама в седьмом положении углеродного атома (С7) до аминогруппы.

Синтез. Образование глюкуронидов 3-оксипроизводных 1,4-бенздиазепинов (оксазепам)

Метаболиты, образованные в результате процессов окисления и восстановления, фармакологически активны. Наибольшей активностью обладают метаболиты, полученные в процессе деалкилирования. Разрыв азепинового кольца при гидролизе 1,4-бенздиазепинов и образование глюкуронидов приводит к потере фармакологической активности. Наряду с основными соединениями продукты метаболизма обнаруживаются во всех тканях организма.

Выводятся производные 1,4-бенздиазепина, в основном, почками в виде основных соединений и метаболитов. Наличие в органах активных метаболитов производных 1,4-бенздиазепина снижает скорость элиминации. Время полувыведения (Т ½) при введении соединений через рот для:

хлордиазепоксида - 8-28 часов

диазепама - 20-42 часа

оксазепама - 10-14 часов

нитразепама - 7-10 часов

Интервал Т 1/2 зависит от принятой дозы LD > 500 мг.

3. Химико-токсикологическое исследование на производные 1,4-бензодиазепина.

Объектами исследования при интоксикации могут быть:

- лекарственные препараты и их остатки;

- биожидкости (кровь - содержит в основном неизмененное соединение, моча - содержит как основное соединение, так и метаболит);

- секционный материал (печень, желудочно-кишечный тракт, почки – содержат основное нативное соединение совместно с метаболитами).

В настоящее время можно выделить два направления в анализе производннх 1,4-бенздиазепина:

I направление - по продуктам гидролиза - 2-аминобензофенонам;

II направление - по содержанию в объектах исследования неизмененных соединений (нативных) совместно с метаболитами.

Основное преимущество исследования производных 1,4-бенздиазепина по продуктам гидролиза - 2-аминобензофенонам – особенно при их получении в процессе деструкции ткани, состоит в том, что данный способ позволяет суммарно определить нативные соединения и ряд метаболитов. При правильном проведении анализа ему придается отрицательное судебно-химическое значение.

При положительном результате необходимо продолжать исследование во втором направлении (по нативному соединению и метаболитам), что позволит более точно установить природу яда (особенно при наличии хлордиазепоксида, диазепама, оксазепама, которые имеют ряд обоих метаболитов и гидролизуются до 2-амино-5-хлор-бензофенона).

СХЕМА ИССЛЕДОВАНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ 1,4-БЕНЗОДИАЗЕПИНА

I этап Гидролиз 1,4-бенз-диазепина

►

120оС, 20 мин.

6 М. HCl

II этап Гидролизат

III этап Экстракция 1,4-бенздиазепинов из гидролизата

►

Экстрагент хлороформ (1:1) 3 раза

IV этап

(УФ-спектрометрия λ max 265 нм λ max 235, 390 нм)

V этап

Анализ производных 1,4-бензодиазепина по 2-аминобензофенонам основан на свойстве соединений образовывать в процессе гидролиза различные по структуре 2-аминобензофеноны, их разделении в тонком слое сорбента и обнаружении на хроматограмме:

- по собственной желтой окраске;

- по азокрасителю, который образуется при сочетании соли диазония 2-аминобензофенона с β-нафтолом или N-α-нафтилэтилендиамином 2НСl (кроме 2-метиламинобензофенона, продукта гидролиза диазепама, т.к. ароматическая аминогруппа блокирована метильным (-СН3) радикалом).

В качестве дополнительного метода идентификации, подтверждающего результаты хроматографического исследования, используется спектрофотомерия в УФ-области, так как аминобензофеноны имеют характерные полосы абсорбции в области 200-400 нм. Количественная оценка содержания 1,4-бенздиазепинов проводится фотометрически по аминобензофенонам на основе реакции получения азокрасителя, с N-α-нафтилэтилен-диаминдихлоридом (реакция Браттона-Маршалла).

3.2. Этапы анализа по нативному соединению и основным метаболитам

1 этап: Извлечение, содержащее производные 1,4-бензодиазепина. Экстракция 1,4-бензодиазепинов в органический растворитель

2 этап: Исследование экстракта методом ТСХ

а) Обнаружение по окраске с реактивом Драгендорфа

Б) обнаружение по реакции образования азокрасителя после гидролиза соединений на хроматограмме.

3 этап: элюирование полосы силикагеля с пластинки, спектрофотомерия.

Исследование по нативному соединению и метаболитам дает возможностъ провести идентификацию производных 1,4-бенздиазепина внутри группы и подтвердить результаты анализа по 2-аминобензофенонам.

ТСХ аминобензофенонов производных 1,4-бенздиазепина Условия анализа:

Неподвижная фаза (сорбент): силикагель, закрепленный гипсом, нанесенный на стеклянную пластинку 9 х 12 см, или пластинки "Силуфол". Подвижная фаза: бензол

Время насыщения камеры парами растворителя – не менее 10 мин. Высота поднятия фронта растворителя – 10 см.

1.3.1. Нанесение веществ на пластинку:

На стартовую линию в 1 и 3 точки нанесите по 2 капли стандартного раствора аминобензофенонов.

Первая точка – АХБ - 2-амино-5-хлорбензофенон, АНБ - 2-амино-5-нитробензофенон

(Зона А)

Вторая точка - объект исследования (экстракт из гидролизата) (Зона Б)

Третья точка - МХБ-2-метил-5-хлорбензофенон (Зона В)

Обнаружение на хроматограмме:

- по собственной желтой окраске;

- по характерной флуоресценции в УФ-области света (254-360 нм)

- по реакции образования азокрасителя с солью дназония аминобезофенонов с щелочным раствором β-нафтола (или N-α-нафтилэтилендиамин дихлоридом).

Методика обнаружения: Обработать слой сорбента зоны А, где располагаются АНБ и АХБ реагентами в последовательности:

- 2 М раствором НСl

- 0,1% раствором NаNO2

- щелочным раствором β-нафтола или раствором N-α-нафтилэтилендиамина. Зону В, содержащую МХБ (бензофенон диазепама) обработать 10% раствором НСlO4 и наблюдать флуоресценцию в УФ-свете при 254 и 360 нм.

- Изолирование из крови и мочи Вследствие особенностей распределения и метаболизма производных 1,4-бензодиазепина, их определение целесообразно проводить по продуктам их гидролиза -аминобензофенонам.

Это позволяет определить общее количество препаратов (как сумму нативного соединения и его метаболитов) в биологической жидкости.

Методика: к 10 мл анализируемой мочи или 2 мл крови добавляют соответственно 10 мл и 2 мл концентрированной HCl и нагревают в колбе или мерной пробирке с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 1 часа. По окончании реакции гидролизат нейтрализуют насыщенным раствором NaOH, доводят рН до 8-10 и экстрагируют дважды хлороформом (10 мл х 2 для мочи и 5 мл х 2 для крови). Слой органического растворителя отделяют на делительной воронке, а затем в объединенных экстрактах упаривают органический растворитель под струей теплого воздуха до объема в несколько капель для ТСХ-анализа и досуха для количественного определения.

В настоящее время, как было сказано выше, можно выделить два основных направления в анализе объектов на 1,4-бензодиазепины:

а) по продуктам гидролиза - аминобензофенонам;

б) по нативным соединениям и метаболитам.

Первое направление предусматривает в основном кислотный гидролиз 1,4-бензодиазепинов и их метаболитов после предварительной экстракции, сорбции или в процессе деструкции ткани до соответствующих аминобензофенонов с последующим использованием для их идентификации сочетания хроматографических (ТСХ, ГЖХ, ВЭЖХ) и спектральных методов.

Второе, более сложное, включает изолирование нативных соединений и ряда гидрофобных метаболитов экстракцией подкисленной водой (органы и ткани) с последующим концентрированием экстракцией органическими растворителями или сорбцией. Для биологических жидкостей используется прямая экстракция органическими растворителями при рН = 6— 8 или сорбция на полисорбе-1. Далее для обнаружения и определения бензодиазепинов и их метаболитов используется комплекс аналитических методов.

Первое направление применимо при определении препаратов Хлозепида, Нозепама, Сибазона, Феназепама, Лоразепама, в меньшей степени Нитразепама (при анализе лекарственных форм и на отдельных этапах исследования биологических объектов). Малоизученным остается данное направление по отношению к Медазепаму.

Основное преимущество исследования 1,4-бензодиазепинов по производным аминобензофенона состоит в том, что данный способ позволяет суммарно определять нативное соединение и ряд его метаболитов. Отрицательному результату анализа гидролизованных бензодиазепинов придается "отрицательное судебно-химическое значение". При положительном результате необходимо продолжать исследование по нативным соединениям, что позволит более точно установить природу яда (особенно в случае Хлозепида, Нозепама и Сибазона).

Исследование по аминобензофенонам включает в себя три основных этапа: кислотный гидролиз, экстракцию аминобензофенонов и анализ экстрактов. Объекты (остатки лекарственных форм, моча, кровь, гомогенаты органов или экстракты из них) заливают 6 М НСl и нагревают при температуре 140 — 145°С в течение 60 минут (кровь, моча, части лекарственных форм, ткани печени, почек) или 80 — 90 минут (стенки желудка или кишечника). В случае направленного исследования на Сибазон, Нозепам, Нитразепам время гидролиза можно сократить до 30 минут, а температуру уменьшить до 120°С.

Аминобензофеноны из гидролизатов экстрагируют органическими растворителями при рН = 6 -8. В случае исследования внутренних органов экстракцию проводят после предварительного отделения гидролизата (фильтрованием, центрифугированием). Экстрагенты—хлороформ-изоамиловый спирт в соотношении 100:1 (гидролизаты тканей и органов, остатков лекарственных форм) или гептан (гидролизаты крови и мочи).

Хроматография в тонких слоях (силикагель) используется в основном при исследовании внутренних органов трупа, мочи и лекарственных форм. Метод предусматривает не только разделение аминобензофенонов, но и их обнаружение по собственной окраске, флюоресценции в УФ-свете (2-метиламино-5-хлорбензофенон), образованию азокрасителя с N-а-нафтилэтилендиамином, β-нафтолом и т.п. Предел обнаружения составляет 1 — 5 мкг аминобен-зофенона в пятне.

Аминобензофеноны из зон, не обработанных реагентами, можно элюировать (спиртом или ацетоном) для снятия электронных спектров и газохроматографического исследования. Основные полосы поглощения аминобензофенонов в этаноле можно наблюдать в области 230 - 240 и 390-410 нм.

При проведении исследования на 1,4-бензодиазепины по нативным соединениям объектами являются кровь, плазма, сыворотка, моча (не менее 10 мл), ткани печени, почек (не менее 200 г), желудок и тонкий кишечник с содержимым (не менее 200 г). Изъятые объекты по возможности быстро должны быть направлены на исследование в замороженном состоянии. Консервирование этанолом не рекомендуется. Анализ биологических объектов на 1,4-бензодиазепины желательно проводить незамедлительно.

Большинство 1,4-бензодиазепинов связывается с белками крови (в основном с альбумином), их терапевтические уровни могут быть определены современными методами ГЖХ и ВЭЖХ. Данные методы с успехом используются и при анализе мочи, иногда в сочетании с хроматографией в тонких слоях. Однако надо учитывать, что если кровь (плазма, сыворотка) является особенно ценным объектом для установления терапевтической, токсической или летальной концентрации 1,4-бензодиазепинов, то информация, полученная при хроматографическом исследовании мочи, позволяет более точно установить природу бензодиазепина. Соотношение концентраций "нативное соединение/метаболит" дает возможность установить длительность нахождения его в организме. Данные хроматографических (ТСХ) исследований производных 1,4-бензодиазепина приведены в таблице.

Таблица 9 . Значения Rf 1,4-бензодиазепинов в различных системах

Обнаружение производных 1,4-бензодиазепина производят реагентами, дающими различные окраски:

а) реактив Драгендорфа в разбавленной кислоте кислоте образует оранжевые и желто-оранжевые комплексные соли;

б) реактив FPN (железа (III) хлорид в смеси хлорной и азотной кислот) окисляет бензодиазепины с образованием окрашенных продуктов желтого цвета;

в) реактив Марки образует окрашенные продукты желтого цвета;

г) подкисленный йодплатинат образует темноокрашенные пятна.

Для ГЖХ обнаружения производных 1,4-бензодиазепина и их метаболитов используется общая система: стеклянная колонка 2 м х 4мм с 2,5% SE-30 на хромосорбе Q (80— 100 меш). Хлозепид и его метаболиты имеют следующие индексы удерживания: Хлозепид — 2453, демоксепам — 2529, дезметилдиазепам — 2496, Оксазепам — 2336, Диазепам — 2425, Нитразепам — 2885, 7-ацетамидо-нитразепам ~ 3263, 7-аминонитразепам — 2900, 7-амино-З-гидроксинитразепам — 2890.

Оптимальной комбинацией в анализе производных бензодиазепина является применение в качестве:

• предварительного метода анализа – метод ПФИА с использованием пороговой концентрации 100 нг/мл,

• подтверждающего метода анализа – метод газовой хроматографиии с масс- селективным детектором или газовой хроматографии с электронно-захватным детектором,

• метода количественного определения – высокоэффективная жидкостная хроматография с диодно-матричным детектором.

Сравнительный анализ методов пробоподготовки таких как жидкость-жидкостная и твёрдофазная экстракция показал, что при использовании ТФЭ:

• сокращается время проведения серийных анализов, что важно в рутинном химико-токсикологическом и судебно-химическом анализе,

• уменьшается расход органических растворителей, а, следовательно, вредное воздействие на персонал и окружающую среду,

• повышается качество извлечений, т.к. фирмами-производителями разработан широкий спектр патронов с высокоселективными сорбентами за счет специально подобранного состава для пробоподготовки биожидкостей, содержащих различные группы лекарственных и наркотических соединений.

Сочетание твердофазной экстракции с вышеперечисленными методами анализа позволяет проводить селективную экстракцию из биожидкостей с высоким выходом определяемых веществ и воспроизводимостью результатов.