Молекулалық –биологиялық зерттеу әдістері және олардың медицина үшін маңызы

Цитогенетикалық әдістердің мәні-микроскоп арқылы адам хромосомаларын зерттеу болып табылады. Бұл әдіс ХІХ ғ. аяғынан қолданылып келеді. Цитогенетикалық әдістер арқылы-хромосома санының не жеке хромосомалардың құрылымын жарық микроскоп арқылы зерттейді. Цитогенетикалық зерттеулер обьекті-бөлінуші (митоз, мейоз) не интерфазалық жасушалар болып табылады.

Молекулалық-цитогенетикалық әдістер-хромосомаларды зерттеудегі жаңа әдіс болып саналады, оны-флюоресцентті будандастыру (гибридтеу) (FISH) деп атайды. Бұл әдіс бірнеше сатылардан тұрады:

1) алғаш зерттелінетін хромосомамен не оның бір учаскесімен будандасатын ДНҚ-зонд дайындалады. ДНҚ зонд-биотон не диоксигенин жалғанған ДНҚ-ның бір тізбегі болып табылады.

2) Микроскопиялық препараттағы хромосма ДНҚ-сын сілті ерітіндісімен өңдеп, оны денатурациялайды, яғни ДНҚ жіпшелері арасындағы сутектік байланыстарды үзеді де, ДНҚ жіпшелерін бір-бірінен ажырастырады.

3) Препаратқа ДНҚ-зондты енгізеді. Осы кезде ДНҚ-зонд нуклеотидтері зерттелетін хромосоманың ДНҚ тізбегіндегі нуклеотидтермен комплементарлық байланысады, яғни ДНҚ рунатурацияланады.

4) Осыдан кейін препараттағы биотон не диоксигенинді олармен таңдамалы қосылатын затпен (биотон үшін стрептовидин, дигоксигенин үшін антидигоксигенин) әрекеттестіреді, содан кейін бұл заттарға 1- кезеңмен флюоросцентті бояуларды (қызыл түсті бояу-родамин,жасыл түсті изотиоцианат флюоресцин) қосады.

5) Люминесцентті микроскоп арқылы боялмаған хромосомалар арасынан боялған хромосомаларды айқын көріп, бақылауға, әрі қарай зерттеуге болады.

FISH әдісі арқылы геннің орналасу орнын анықтаудан бастап бірнеше хромосомалық күрделі қайта құрылымдарды ажыратуға мүмкін болады. FISH әдісі анеуплоидияларды анықтау үшін де қолданылады.

№2 дәріс

Тақырыбы: Белоктардың жалпы сипаттамасы

Жоспар: 1. Белоктардың молекулалық массасы

2.Белоктардың биологиялық функциясы

3. Белоктарды бөлу және тазалау әдістері

Жер жүзіндегі тірі ағзалардың негізгі құрамды бөлігі – белок. Ф. Энгельс өзінің «Табиғат диалектикасы» еңбегінде: «Өмір дегеніміз – белокты денелердің тіршілік ету тәсілі» деген.

Демек белок барлық тірінің негізі, ал олардың тіршілік ету тәсілі - өмір болып табылады.

Тірі ағзаның құрамына кіретін белоктар немесе протеиндер (protos – бірінші, алғашқы, маңызды деген грек сөзі) органикалық қосылыстардың 50-85% - ын құрайды.

1871ж. орыс химигі Н.Н. Любавин белоктар амин қышқылдарынан тұратынын анықтады.

Белоктар цитоплазма мен ядроның негізін құрайды. Олар табиғатта кездесетін органикалық заттардың ішіндегі ең күрделісі. Белоктардың элементтік құрамы:

Көміртегі – 50-55%

Оттегі – 21-24%

Азот – 15-18%

Сутегі – 6-7%

Күкірт – 03-2,5%

Кейбір белоктік заттардың құрамына фосфор кіреді, аз мөлшерде кейде темір, мыс, иод, хлор, бром, кальций, мырыш және т.б. элементтер де кездесуі мүмкін.

Белоктардың басқа полимерлерден өзгешелігі – олар құрылысы жағынан бір – біріне ұқсас болғанымен мүлдем басқа мономерлерден құралған.

Белоктың молекулалық салмағы оның құрамындағы аминқышқылдарының санына байланысты. Мысалы, инсулин белогінің құрамында 51 аминқышқылдарының қалдығы бар, екі полипептидтік тізбектен тұрады, молекулалық салмағы 5733, ал гемоглобиннің құрамында 574 аминқышқылдарының қалдығы бар,молекулалық салмағы 64500. Әртүрлі белоктардың құрамындағы аминқышқылдары қалдықтарының саны әртүрлі- 100-ден бірнеше мыңдаған. Белоктың молекулалық массасын әртүрлі физико-химиялық әдістермен анықтауға болады, солардың ішінде кең тарағаны: электрофорез, молекулалық тор әдісі, ультрацентрифугалау т.б.

Нақтылы нәтиже алу үшін бір ғана әдісті емес, әртүрлі әдістерді пайдаланады. Осы әдістерді қолдана отырып белоктың молекулалық салмағы өте кең аралықта ауытқитыны анықталған, 6 мыңнан бірнеше миллион дальтон аралығында.

1. Катализаторлық, ферментативтік қызметі. Ферменттер химиялық құрамы жағынан — белоктар. Олар организмдегі әртүрлі химиялық реакциялардың, процестердің жүру қарқынын реттейді.

2. Тасмалдаушы қызмет атқарады. Айталық қан құрамындағы гемоглобин деген белок оттегін өзіне байланыстырып әртүрлі мүшелердегі ұлпалар мен клеткаларға тасымалдаса, екінші бір қандағы альбумин деген белок май қышқылдарын тасмалдайды.

3.Организмнің қозғалуын қамтамасыз ететін белоктар, оларға бұлшық еттегі актин мен миозин белоктарын жатқызуға болады жөне клетка мембранасындағы тасмалдаушы белоктар т.б.

4.Қорғаныштық қызметі, ондай белоктар организмнің иммундық қасиеттерін жүзеге асырады, қанның ұюы қан сары суының құрамыңдағы фибриноген белогінің фибринге айналуына байланысты. Бұл да белоктың қорғаныштық қасиетін көрсетеді.

5. Көптеген белоктар биологиялық активті заттар. Солардың ішінде гормондар, токсиндер т.б.

6. Белоктардың құрылымдық қызметі. Олар кез-келген клетка протоплазмасының негізі бола отырып, құрылымдық элементтерін қүрайды. Жоғарғы сатыдағы жануарлардағы талшықты коллаген деген белок дәнекер және сүйек үлпаларының қүрамына кіреді, ал α - кератин белогі шаш, тырнақ, жүн, қауырсындардың негізін құрайды. Белоктар жасушадағы липидтермен байланыса отырып жасушалардың, жасуша ішіндегі органоидтардың мембранасын құрайды.

7.Қор ретінде жиналатын белоктар: сүт- казеині, жұмыртқа белогы - альбумин, өсімдік дәніндегі көптеген әртүрлі қор белоктары.

8.Рецепторлық қызметі. Көптеген белоктар, әсіресе гликопротеидтер, таңдамалы түрде белгілі бір заттармен байланысады.

Белоктардың қызметі жоғарыда көрсетілген функцияларымен шектеліп қоймайды. Айталық реттеуші белоктарға ферментгер мен гормондардан басқа да белоктарды жатқызуға болады. Мысалы, гендердің ферменттердің белсенділігін реттейтін белоктар. Сонымен қатар белоктардың халық шаруашылығында да маңызы зор.

Адам тамағының және жануарлардың азығының негізін белоктар құрайды. Жем-шөп құрамындағы белоктың сапасы мен мөлшері ауыл-шаруашылық жануарларының өнімін анықтайды. Көптеген өнеркөсіптердің технологиясы белоктардың қасиеттерін өзгертуге негізделген, атап айтқанда теріні, табиғи жібектерді өндеу. Нан пісіретін өндірістерде ұнның құрамындағы белоктың қасиеті мен сапасы өте маңызды роль атқарады.

Белоктардың құрылымы мен атқаратын қызметін зерттеу үшін биологиялық материалдардан белоктарды бөліп алу қажет. Алдымен биологиялық материалдарды (шикі затты) гомогенді күйге дейін ұсақтайды. Ұсақталған биологиялық материалда белок макромолекуласының жоғары құрылымын ұстап тұрған байланыстар үзіледі, белок молекуласында гидрофобты, гидрофильді топтар саны өзгереді. Бұл белоктың ерігіштігіне әсерін тигізеді. Кейбір белоктар суда ериді, басқа біреулері тұздардың сұйық ерітіндісінде немесе су мен спирт қоспасында ериді. Тіпті ешқандай ерігішті де ерімейтін белоктар да бар.

Ұсақталған белоктарды жасуша құрылымдарынан бөлу үшін гомогенезаторлар, кварц құмымен келіде ұнтақтау (бұл жануарлар жасушалары үшін), ультрадыбыс, шарлы диірмендер (өсімдік жасушалары үшін) қолданылады. Жасуша құрылымдарынан тазартылған белокты диализ әдісін қолданып бос жүрген кіші молекулалардан тазартады. Белоктарды диализдегенде молекулалар мен иондар жартылай өткізгіш мембрана арқылы оңай өтіп, еріткішке көшеді. Ал, коллоидты бөлшектер мөлшері үлкен болғандықтан жартылай өткізгіш мембрана арқылы өтпейді. Еріткішті жиі-жиі ауыстыру арқылы белоктың коллоидты ерітіндісіне бөгде заттардан осылайша тазартады.

Белокты тұнбаға түсіріп шөктіру үшін көбінесе аммоний сульфаты тұзының концентрлі ерітіндісі, сілтілік металдардың және ауыр металдардың тұздары (мыс, сынап, қорғасын, күміс, т.б.) қышқылдар мен гидроксид, спирт ерітнділері (метанол, бутанол т.б.) қолданылады. Алынған белоктар қоспасын жеке дара белоктарға немесе фракцияларға бөледі. Түрлі фракцияға бөлуді хроматографиялық әдіс көмегімен жүргізеді. Хроматографиялық әдістің түрлі модификациялары қолданылады: адсорбциялы, газды, сұйықтықты, гельді, копилярлы, ион алмасу және т.б. сонымен қатар биохимияда ғылыми зерттеулердің мүмкіндігін арттыруға ерекше үлес қосқан рентген құрылымдық анализ, электронды микроскопия, таңбаланған атомдар әдісі, инфрақызыл және ультракүлгін анализ, электрофорез, молекулярлы елек әдісі, масс спектрометрия, ультрацентрифуганы пайдалану, магнитті – оптикалық айналудағы дисперсиялық әдістер, электронды парамагнитті резонанс, ядролық магнитті резонанс және т.б.

Қазіргі кезде бірқатар автоматты биохимиялық анализаторлар, лабораториялар құрылып жұмыс істеуде. Осындай автоматты системалар анализін басқаруда және алынған хабарларды өңдеуде ЭЕМ қолданылады.

Белок молекуласы өте сезімтал, әр түрлі жағдайлардың (қышқылдың, сілтінің, органикалық еріткіштердің, температураның) әсерінен өзінің табиғи қасиетін жоғалтып жоғалтып денатурацияға түседі, сондықтан да белокты бөліп алу төменгі температурада (+4⁰) жүргізіледі. Алынған белок ерітіндісінде жеке белок емес, белоктар қоспасы болады.

Жеке белокты бөліп алу үшін әр түрлі әдістер қолданылады. әдістерді таңдап пайдалану тәжірибелік жолмен алға қойылған мақсатқа сәйкес, ең алдымен бөліп алынатын белоктың физико-химиялық қасиетіне байланысты болады.

№3 дәріс

Тақырыбы: Белоктардың физико-химиялық қасиеттері

Жоспар: 1.Белоктардың химиялық құрылысы

2. Амин қышқылдарының қышқылды-негізді қасиеттері

Белоктың амфотерлік қасиеті, құрамындағы амин қышқылдарының бүйірлік топтарына байланысты. Табиғи белоктардың көшпілігі қышқыл белоктар, олардың құрамында екі карбонды амин қьшқылдары бар, олар негізінен глобула бетінде орналасқан және белок молекуласының физико-химиялық қасиеттерін анықтайды. Зарядтардың молекула үстінде орналасуы бірдей емес, оның әртүрлі аймақтарында бір-біріне қарама-қарсы зарядтар болуы мүмкін. рН- тың өзгеруі радикалдардың диссоциациялану бағытына әсер етеді, молекула үстіндегі зарядтар алмасады, нәтижесінде белоктың кеңістігіндегі құрылымы және оның биологиялық активтілігі өзгереді. Белок молекуласы металл иондарымен, тағы да басқа зарядталған макромолекулалармен әрекеттеседі. Белоктардың катиондармен және аниондармен әрекеттесу қабілетінің үлкен биологиялық мәні бар. Мысалы, белоктардың кальций ионымен байланысуы зат алмасу процестерін реттеуге қатыса отырып көптеген физиологиялық процестерде өте маңызды роль атқарады.

рН-тың белгілі бір деңгейінде белок молекуласының оң заряды мен теріс заряды теңеседі, яғни белок нейтральді, зарядсыз, электр тогы жүйесінде қозғалмайды. рН-тың осы деңгейін сол белоктың изоэлектрикалық нүктесі (ИЭН) дейді. Белок өзінің ИЭН-де тез және толық ертіндіден тұнбаға түседі.

Егер белок құрамында негіздік аминқышқылдары қалдықтары көп болса, онда олардың ИЭН 7-ден жоғары, ал егер қьшқылдық аминқышқыл қалдықтары басым болса ИЭН 7-ден төмен. Көптеген глобулярлы белоктардың ИЭН қышқылдық аралықта (4,5-6,5) болады.

Көптеген белоктар өзінің биологиялық активтілігін, атқаратын қызметін температура мен рН-тың өзіне тән арнаулы деңгейінде ғана сақтай алады. рН-пен температураның экстремалды көрсеткшінде белок молекуласы өзгеріп денатурацияға түседі. Көптеген белоктарда денатурация температураны 50-60°-қа көтергенде байқалады. Жүмыртқа альбуминінің ертіндісін ақырындап 60-70°С-қа дейін қыздырса, алдымен ертінді лайланады, біраз уақыттан кейін ұйып қалады. Осындай құбылыс барлық глобулярлы белоктарды қыздырғанда байқалады. Денатурацияны тек температурамен ғана емес белок ертіндісіне кейбір органикалық ертінділермен (спирт, ацетон) мочевинамен, басқа да детергентермен әсер ете отырып та жасауға болады. Ауыр металл катиондары йод, тиоцианат аниондары ертіндідегі белоктарды денатурацияға түсіреді. Көптеген белоктар өте қышқылдык немесе өте сілтілік ортада ұйып, денатурацияланады. Тіптен механикалық күштердің өзі де, атап айтқанда жоғарғы қысым, құрғақ препараттарды езу, белок ертіндісін қатты шайқау белокты денатурациялайды. Физикалық факторлардың ішінде қыздырудан басқа белок денатурациясына әсер ететін ультракүлгін жарығы, ионизация сәулелері. Денатурация кезінде белоктың көптеген физико-химиялық қасиеттері өзгереді: ерігіштігі төмендейді, тіптен бұл қасиеті жойылады, оптикалық касиеттері, тұтқырлығы (вязкость) т.б. өзгереді. Белок өзіне тән биологиялық активтілігін, атқаратын қызметін жояды. Ферменттер инактивацияланып, каталитиздік қасиетінен айырылып химиялық реакцияны жүргізе алмайды. Денатурация кезінде белоктың кеңістіктегі құрылымы өзгереді (төртінші, үшінші, тіптен екінші деңгейдегі құрылымдар). Тек бірінші деңгейдегі құрылымы, яғни полипептидтік тізбектегі аминқышқыл қалдықтарының реттеліп орналасу тәртібі сақталады. Белоктың толық денатурацияға ұшырауы көптеген жағдайларда қайтымсыз, бірақ белгілі қолайлы жағдайды жасай отырып денатурацияға ұшыраған белокты қайтадан бастапқы