Лабораторная диагностика

Существует множество лабораторных методик для диагностики урогени-тального хламидиоза.

Морфологические методы исследования основаны на выявлении включений хламидий при использовании различных методов окраски мазков и при элек­тронной микроскопии.

Наиболее распространенными методами окраски являются окраска по Романовскому—Гимзе и раствором Люголя, но учитывая низкую чувствитель­ность и информативность этих методов (25—30%), в современной диагностике они используются крайне редко.

Электронная микроскопия позволяет визуализировать микроколонии хлами­дий в культуре клеток и персистентные формы хламидий, а также получить дополнительные бактериологические данные о характере сопутствующей микро­флоры. Материалом может служить не только эпителий слизистых оболочек половых путей, но и биопсийный материал из пораженных тканей (спайки, маточные трубы). Для диагностики персистенции хламидий при исследовании ориентируются на наличие атипичных включений:

• гигантские ретикулярные тельца с расширенным периплазматическим пространством;

• деление протопласта ретикулярного кольца и отшнуровка мелких шаро­видных форм в периплазматическом пространстве;

• мелковакуолярные включения, лежащие на периферии клеток, медленно транспортирующиеся в перинуклеарную зону;

• огромное количество мембранных пузырьков неправильной формы вну­три ретикулярных телец.

Недостатком метода является высокая стоимость и малая доступность обследования для широкого круга пациентов, недостаток высококвалифици­рованных специалистов.

роль инфекции и факторов реактивности организма в клинике, диагностике и лечении

наиболее часто встречающихся воспалительных заболеваний женских половых органов 217

Более высокой чувствительностью и специфичностью (90—95%) обладает ИФА, который рекомендован МЗ и СР РФ для диагностики хламидиоза. При непрямой флюоресценции гипериммунную сыворотку наносят на предметное стекло с исследуемым материалом. После отмывания препарат окрашивают соответствующим антиглобулином, меченным флюоресцирующей краской. Результат оценивают при люминесцентном микроскопировании. При непря­мой иммунофлюоресценции в качестве реактива используются моноклональ-ные антитела. Использование моноклональных антител исключает возмож­ность ложноположительных результатов, которые при непрямой иммуно­флюоресценции могут иметь место за счет нежизнеспособных хламидий, а также других бактерий, имеющих перекрестно реагирующие антигены. По одной из методик ЭТ выявляются в мазках, взятых с инфицированных участ­ков. Принцип метода заключается в использованиии моноклональных анти­тел, меченных флюоресцирующим изотиоционатом против ГБНМ хламидий, имеющегося во всех известных сероварах С. trachomatis, а также у РТ и ЭТ. При просмотре мазков в люминесцентном микроскопе видны ярко-зеленые элемен­тарные или РТ на красно-коричневом фоне окрашенных клеток. Для правиль­ной оценки результата в мазке должно быть не менее 50 эпителиальных клеток.

Метод прямой иммунофлюоресценции предусматривает прямое выявление антигенов хламидий. При люминесцентной микроскопии включения хлами­дий определяются в виде зеленой или желто-зеленой флюоресценции включе­ний на коричнево-оранжевом фоне цитоплазмы клеток. Включения могут иметь зернистую, гомогенную или смешанную структуру.

К недостаткам этих методов относят: субъективность интерпретации полу­ченных результатов; трудности при работе с большим количеством мазков; слож­ность диагностики при наличии смешанной инфекции, что связано с тем, что при этом слизистая оболочка за счет большого количества лейкоцитов покрыта слоем белка, следствием чего могут быть ложноположительные результаты; зависи­мость результата исследования от тщательности и правильности забора материа­ла; недостаточное количество высококвалифицированных специалистов.

Метод выделения хламидий в культуре клеток.Соскоб материала производят с пораженного участка ложкой Фолькмана или специальными щетками. Взя­тый материал помещают в транспортную среду (фосфатный буфер с сахарозой, с добавлением инактивированной нагреванием сыворотки крупного рогатого скота, стрептомицина, амфоторецина).

Для исследования используют культуру клеток, чаще McCoy, обработанных циклогексемидом. Забранный материал наслаивается на монослой культуры клеток, выращенных на покровных стеклах, с предварительным удалением ростковой среды. Затем зараженная клеточная культура помещается во флако­ны и центрифугируется в течение 1 ч при 3000 об./мин, что увеличивает число внутриклеточных включений. После центрифугирования материал сливают в пробирки, куда добавляют изолирующую среду «Игла» («Eaglas MEM») с циклогексимидом в концентрации 2 мкг/мл. Пробирки инкубируют в термо­стате при температуре 37°С в течение 48—72 ч (время соответствует циклу развития хламидий). Затем покровные стекла с монослоем достают из проби­рок, укладывают на предметные стекла монослоем вниз в канадском бальзаме и определяют включения возбудителя. Перед этим проводят фиксацию и окра­ску мазка (окрашивание проводится по Романовскому—Гимзе, раствором Люголя либо флюоресцирующими антителами).

Из существующих методов диагностики этот метод самый трудоемкий и Дорогостоящий, требующий специального оснащения лаборатории, высоко-

218 Глава II

квалифицированного персонала и соблюдения особых правил транспортиров­ки клинического образца для исследования. Исследование занимает от 3 до

7 сут. Все вышеизложенное делает метод малодоступным для широкого ис­
пользования в амбулаторной сети. Только специализированные медицинские
учреждения могут проводить подобные исследования и гарантировать диагно­
стическую точность метода.

Большие успехи в области молекулярной биологии не оставили в стороне и диагностику хламидийной инфекции. Методы молекулярной диагностики основаны на определении специфических для С. trachomatis последовательнос­тей олигонуклеотидов ДНК или рибосомальной РНК. Новым методом ДНК-диагностики, который может обогнать по чувствительности все остальные методы молекулярной биологии, является ПЦР. Она позволяет производить амплификацию определенных последовательностей ДНК путем повторных циклов высокотемпературной денатурации, нуклеотидного отжигания и опо­средованного полимеразного вытягивания цепи. После 25 циклов достигается увеличение в сотни раз той последовательности ДНК, которая исследуется.

По мнению ряда авторов, ПЦР сходна по чувствительности с ИФА, более чувствительна, чем заражение клеточной культуры. Однако применяя этот метод, следует учитывать, что, помимо обычных для микробиологических лабораторий предосторожностей, следует принимать меры для предотвраще­ния присутствия даже следов ДНК патогенов. Для постановки метода необхо­димо достаточное количество помещений для разобщения отдельных этапов работы, строгое соблюдение техники исследования. Достоверность результатов зависит и от качества забора материала, и от его хранения.

Для определения ДНК хламидий часто используют весьма информативный метод точечной гибридизации (дот-гибридизации) нуклеиновых кислот на твер­дой фазе с использованием ДНК-зонда, меченного биотином. Из исследуемых образцов выделяют суммарную ДНК, образцы исследуемой ДНК и контрольные образцы денатурируют кипячением, фиксируют на нитроцеллюлозном фильтре и гибридизируют с предварительно денатурированным биотипированным ДНК-зондом. Несвязавшийся зонд удаляют путем отмывки фильтра. На следующем этапе фильтр обрабатывают конъюгатом страптавидина с щелочной фосфатазой.

На заключительном этапе выносят субстратный раствор. Окрашивание со­ответствующих точек свидетельствует о наличии тестируемой ДНК в исследуе­мом материале (Гаспаров А.С. и др., 2003; Дмитриев Г.А. и др., 1999; Латыпо-ваМ.Ф., 2001).

В настоящее время для диагностики хламидийной инфекции широко используются серологические методы исследования, чаще всего это ИФА. Метод основан на иммуноферментной реакции антиген—антитело с последующим окрашиванием конечного продукта и оценкой результата реакции на спектро­фотометре. Для этих целей используют диагностические наборы фирм «Medac Diagnostica» (Германия), «Labsystem» (Финляндия), «Orgenics» (Израиль).

В тест-системах фирмы «Medac diagnostica» (Германия) производится опреде­
ление антител к антигенам: родоспецифическому ЛПС хламидий r-ELISA
(IgM, IgG, IgA к Chlamydia) и ГБНМ (IgG, IgA-антитела) С. trachomatis, а также
IgG-антитела к Hsp 60 хламидий.

Достоинствами ИФА являются: высокая чувствительность и специфич­ность, простота постановки реакции, возможность одновременного обследова­ния большого количества пациентов, объективная оценка результатов.

На сегодняшний день врачи нередко выбирают только одну из методик, максимально, по их мнению, информативную и доступную (ПЦР-диагности-

Роль инфекции и факторов реактивности организма в клинике, диагностике и лечении

наиболее часто встречающихся воспалительных заболеваний женских половых органов 219

ка, ПИФ). Полноценная диагностика урогенитального хламидиоза возможна только при использовании совокупности различных методов исследования.

Следует учитывать жалобы пациенток, данные анамнеза и клинического осмотра. Необходимо подтверждать предполагаемый диагноз обязательным сочетанием прямых и непрямых методов лабораторной диагностики. Целесо­образным является сочетание прямого и непрямого методов диагностики. В качестве прямого метода используется ПЦР, которая является высокоинфор­мативной (чувствительность и специфичность, по мнению разных авторов, колеблется от 80 до 100%), применима для скринингового обследования, эко­номически доступна. В качестве непрямого метода — ИФА, который позволяет поставить диагноз при восходящей хламидийной инфекции, получить допол­нительную информацию о течении заболевания.

Метод ПЦР дает возможность выявить у части пациенток специфические фрагменты ДНК С. trachomatis в секрете генитального тракта и начать своевре­менное лечение. Использование ИФА позволяет подтвердить диагноз «уроге-нитальный хламидиоз» на основании определения диагностически значимого титра антител к С. trachomatis в сыворотке крови пациенток.

У пациенток с восходящей хламидийной инфекцией определение антител к C.trachomatis в диагностически значимых титрах часто является единственным критерием правильной диагностики и проведения адекватного лечения.

Результаты ИФА позволяют оценить «остроту» течения заболевания исходя из сроков выработки, уровня, длительности определения IgG, IgA к С. tracho­matis, а также IgG к Hsp 60 хламидий в сыворотке крови пациенток. Высокий титр IgG и/или IgA к С. trachomatis при отсутствии IgG к Hsp 60 С. trachomatis свидетельствует об остром процессе либо об обострении хронического. Дли­тельное определение в сыворотке крови диагностически значимых титров только IgG и/или IgA к С. trachomatis позволяет предположить хроническое течение заболевания. Неоднократное выявление специфических антител к С. trachomatis без тенденции к снижению, а также выявление IgG-антител к Hsp 60 хламидий в сыворотке крови пациенток с урогенитальным хламидиозом в диагностически значимых титрах указывают на персистентное течение хла­мидийной инфекции (Алешкин В.А. и др., 2004; Скирда Т.А. и др., 2004).

Определение специфических антител методом ИФА может быть использо­вано для контроля за эффективностью проводимой терапии по изменению уровня специфических Ig к С. trachomatis в сыворотке крови больных до начала терапии и в разные сроки после окончания лечения, а также как критерий излеченности после проведенного курса терапии (Алешкин В.А. и др., 2004).

Современные подходы к диагностике различных форм хламидийной инфекции представлены в таблице 2.31.