Ферменты микроорганизмов

Общая характеристика

Все разнообразные и многочисленные биохимические реакции, протекающие в живом организме в связи с его обменом веществ, совершаются при участии ферментов — биологических катализаторов, вырабатываемых клетками организма.

Ферменты "есть в полном смысле возбудители жизни", — писал академик И. П. Павлов.

Структура, и свойства, ферментов. Ферменты пред­ставляют собой белки простые (протеины) или сложные (про­теиды), состоящие из белка и небелкового компонента — активном группы. Таким образом, есть ферменты одноком­понентные и двухкомпонентные.

В состав активной группы двухкомпонентных фермен­тов входят витамины или их производные, различные ме­таллы (Ре, Со, Си), азотистые основания и др.

Активная группа ферментов обусловливает их катали­тическую способность, а белковая часть — специфические свойства, избирательную способность действовать на опре­деленный субстрат.

Прочность связи активной группы с белком у разных ферментов неодинакова. У некоторых она легко может отде­ляться от белковой части фермента и вступать во времен­ную связь с другими белками. Такие активные группы на­зывают коферментами.

Активные группы, прочно связанные с белковой час­тью фермента, называются простатическими группами этих ферментов.

В однокомпонентных ферментах роль активной группы выполняют определенные химические группировки в моле­куле белка, составляя активный (каталитический) центр фермента.

Ферменты обладают очень высокой активностью. Нич­тожно малого количества фермента достаточно, чтобы вов­лечь в реакцию значительную массу реагирующего веще­ства (субстрата). Например, 1 г амилазы при благоприятных условиях может превратить в сахар 1 т крахмала.

Ферменты действуют чрезвычайно быстро, резко ус­коряя реакцию. Молекула фермента за 1 мин может вызвать превращение десятков и сотен тысяч молекул соответству­ющего субстрата.

Особенностями ферментов являются их субстратная спе­цифичность и специфичность действия — каждый фермент взаимодействует лишь с одним определенным веществом и катализирует лишь одно из тех превращений, которым мо­жет подвергаться данное вещество.

Специфичность ферментов обусловлена структурными особенностямиих молекул и субстрата. Субстрат и фермент подходят друг к другу, как ключ к замку.

Катализируемая однокомпонентным ферментом реакция начинается со связывания субстрата с ферментом в опреде­ленном участке его — активном центре. Образуется комп­лекс фермент — субстрат. По окончании реакции образо­вавшийся комплекс фермента с продуктами реакции распадается, и при этом освобождаются исходный фермент и ко­нечные продукты ферментативного процесса (рис. 19).

У двухкомпонентных ферментов в связывании и пере­носе отдельных фрагментов субстрата участвуют коферменты и простетические группы.

Ферменты отличаются неустойчивостью (лабильностью) к воздействию ряда факторов внешней среды. Эта неустой­чивость во многом объясняется белковой природой фермен­тов и выражается в том, что они теряют свою активность (инактивируются).

Рис. 19. Схема взаимодействия комплекс активированный фермента с субстратом

Условия действия ферментов. Важнейшим фактором, определяющим активность ферментов, является темпера­тура. По мере повышения температуры возрастает началь­ная скорость ферментативной реакции. Однако по достиже­нии известного предела дальнейшее повышение темпера­туры вызывает денатурацию ферментного белка.

Уровень температуры, вызывающий денатурацию раз­личных ферментов, неодинаков. Для одних ферментов это 40-50°С, для других (термоустойчивых) — только 70"С, но при температуре около 100"С почти все ферменты инакти­вируются.

Некоторые ферменты после тепловой инактивации вос­станавливают каталитическую активность (в случае обрати­мого процесса денатурации белка).

Оптимальная температура, при которой данный фер­мент наиболее активен, для разных ферментов различна и в известной мере характеризует каждый фермент. У холодолюбивых микроорганизмов температурный оптимум фермен­тов значительно ниже, чем у теплолюбивых.

При температуре ниже оптимальных пределов скорость ферментативных процессов уменьшается. В условиях темпе­ратур, близких к нулю и особенно ниже нуля, эти реакции значительно замедляются, а некоторые приостанавливают­ся, хотя при таких температурах ферменты заметно не раз­рушаются.

Большое влияние на ход ферментативных процессов оказывает рН среды. Для действия каждого фермента име­ется свое оптимальное значение рН среды. При значении рН выше или ниже оптимальной величины активность фер­ментов снижается.

На активность ферментов влияет и присутствие в среде некоторых химических веществ. Одни из них ускоряют ферментативную реакцию (активаторы), другие — снижают ее или полностью приостанавливают (ингибиторы). Действие многих активаторов и ингибиторов специфично.

Активаторами ферментов являются, например, метал­лы (Сu, Мn, Мg, Со), витамины.

Ингибиторами ферментов служат соли тяжелых метал­лов, антибиотики, Н₂S и др. Ингибиторы соединяются с ак­тивными группами или активными центрами ферментов, парализуя тем самым связывание с ними субстрата.

Лучистая энергия (ультрафиолетовые лучи, радиоак­тивные излучения) инактивирует ферменты.

Концентрация субстрата, т. е. вещества, на которое действует фермент, и концентрация фермента также вли­яют в известной мере на скорость процессов.

Биохимические процессы, протекающие в микробных клетках, регулируются ферментами, поэтому любой фак­тор, действующий на активность фермента, действует и на микроорганизм.

Каждый микроорганизм обладает комплексом разнооб­разных ферментов, своеобразием и активностью которых определяются их биохимическая деятельность, избиратель­ность в отношении питательных веществ, роль микроорга­низмов в круговороте веществ в природе, в процессах порчи пищевых продуктов.

Ферменты, присущие данному микроорганизму, входя­щие в число компонентов его клетки, называют конститу­тивными. Существуют ферменты индуцируемые {адаптив­ные), которые вырабатываются клеткой только при нали­чии в среде вещества (индуктора), стимулирующего синтез данного фермента. Например, микроорганизм, не ассими­лирующий мальтозу, можно приучить к использованию ее, культивируя в среде с этим сахаром как единственным ис­точником углерода. В этих условиях микроорганизм синте­зирует фермент, которым ранее он не обладал.

В живой клетке действие ферментов происходит упо­рядочение, строго согласованно. Ферменты локализованы в различных клеточных структурах (в мезосомах, митохонд­риях, цитоплазматической мембране и др.).

Некоторые ферменты выделяются микроорганизмами наружу (в среду), их принято называть экзоферментами.

Они играют большую роль в подготовке пищи к ее поступ­лению в клетку. Происходит внеклеточное "переваривание" пищи — расщепление сложных веществ субстрата (крахма­ла, белков и др.) на более простые, способные проникать в клетку.

Ферменты, прочно связанные с цитоплазмой, не выде­ляющиеся при жизни клетки в окружающую среду, называ­ют эндоферментами (внутриклеточными). Они участвуют во внутриклеточных процессах обмена веществ.

Хотя ферменты и вырабатываются клеткой, они после ее гибели временно остаются в активном состоянии, и мо­жет произойти автолиз (от греч. аutos — сам, lysis — ра­створение) — саморастворение, или самопереваривание, клетки под влиянием ее внутриклеточных ферментов. При разрушении клеток ферменты поступают в среду — суб­страт, в котором развивались микроорганизмы. При хране­нии пищевых продуктов, значительно обсемененных мик­роорганизмами, даже в условиях, исключающих их разви­тие, возможно снижение качества продуктов за счет фер­ментов автолизированных микробных клеток.

Классификация ферментов

Номенклатура ферментов складывалась постепенно, по мере их открытия и изучения. Названия ферментов вначале носили случайный характер. Например, фермент, расщеп­ляющий крахмал, был назван диастазом, а фермент желу­дочного сока, расщепляющий белки, — пепсином. Позднее название фермента стали составлять из корня слова, обо­значающего вещество, на которое действует фермент, до­бавляя к нему окончание "аза". Так, фермент, расщепляю­щий крахмал (амилум), стали называть амилазой, фермент, разлагающий мальтозу, — мальтазой и т. п. Наряду с этим ферменты называют и по функции — по химической реак­ции, которую они катализируют. Например, ферменты, катализирующие отщепление водорода от субстрата (дегид-рогенирование), называют дегидрогеназами, а расщепляю­щие "сложные органические соединения путем гидроли­за — гидролазами.

В настоящее время известно более 2000 ферментов.

В соответствии с принятой в настоящее время класси­фикацией ферментов (Правила номенклатуры ферментов, 1972) все ферменты делят на шесть классов: 1-й — оксидо-редуктазы; 2-й — трансферазы; 3-й — гидролазы; 4-й — лиазы; 5-й — изомеразы; 6-й — лигазы. Классы подразде­ляют на подклассы, которые делят на подподклассы. Каж­дый фермент имеет название и шифр из четырех цифр. Первая цифра обозначает класс, вторая — подкласс, тре­тья — подподкласс, четвертая — порядковый номер данно­го фермента.

Ниже рассматриваются только некоторые наиболее распространенные ферменты микроорганизмов.

Оксидоредуктазы, — окислительно-восстановитель­ные ферменты. В этот класс входят многочисленные фер­менты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции процессов энергетического обмена (дыхания, бро­жения) микроорганизмов. К оксидоредуктазам относятся сле­дующие ферменты.

Дегидрогеназы — ферменты, катализирующие реак­цию дегидрогенирования органических соединений: отщеп­ление водорода. Отнятый водород передается дегидрогена-зой какому-либо другому веществу (промежуточному — вре­менному или конечному акцептору водорода). Одновременно одно вещество окисляется, а другое восстанавливается.

Дегидрогеназы специфичны по отношению к донору водо­рода и к его акцептору. Их делят на анаэробные и аэробные.

Анаэробные (первичные) дегидрогеназы передают отня­тый от окисляемого субстрата водород другим дегидрогена-зам или молекулам каких-либо органических веществ, но не кислороду воздуха. Эти дегидрогеназы являются двух­компонентными ферментами. Кофермент многих анаэробных дегидрогеназ — никотинамид-аденин-динуклеотид (сокращен­но НАД) (см. схему на с. 63).

Коферментом других анаэробных дегидрогеназ являет­ся никотинамид-аденин-динуклеотид-фосфат (НАДФ).

Анаэробные дегидрогеназы имеются как у анаэробов, так и у аэробов.

Аэробные (вторичные) дегидрогеназы передают активиро­ванный водород, отнятый у окисляемого вещества или от вос становленной анаэробной дегидрогеназы, кислороду воздуха непосредственно либо через промежуточных переносчиков.

Аэробные дегидрогеназы, передающие водород субстра­та непосредственно кислороду, называют оксидазами. К оксидазам относится, например, полифенолоксидаза, катали­зирующая реакцию окисления, полифенолов с образовани­ем темноокрашенных соединений — меланинов. Этот фер­мент имеется у многих плесневых грибов. Действие полифенолоксидазы проявляется в потемнении тканей плодов и ово­щей, пораженных этими плесенями.

К аэробным дегидрогеназам относятся флавиновые фер­менты, коферментом которых является флавин-аденин-ди-нуклеотид (ФАД). В состав кофермента входит рибофлавин (витамин В₂). Одни флавиновые ферменты могут переносить водород непосредственно на кислород, т. е. являются окси­дазами; другие передают водород от окисляющихся веществ кислороду через ряд промежуточных переносчиков. В таких случаях участвуют системы ферментов, а водород многократно переносится от одного вещества к другому, пока не достигнет своего конечного акцептора — кислорода. После­дний подвергается восстановлению с образованием воды или перекиси водорода.

Особо важное значение в процессах аэробного дыхания имеетцитохромная ферментная система, состоящая из цитохромов и фермента цитохромоксидазы.

Цитохромы, представляют собой гемопротеиды. В состав простетической группы (гема), функционирующей как пере­носчик электронов, входит двухвалентное железо. Роль цитохромов в процессе дыхания заключается в последователь­ном переносе электронов от водородного атома восстанов­ленной дегидрогеназы на цитохромоксидазу.

Цитохромоксидаза — двухкомпонентный гемосодержащий фермент, катализирует окислительно-восстановитель­ную реакцию между восстановленным цитохромом (после­дним в цепи цитохромов) и кислородом.

Цитохромная система содержится в клетках всех микро­организмов, за исключением облигатно-анаэробных бактерий.

Каталаза — двухкомпонентный фермент, расщепляет перекись водорода на воду и молекулярный кислород.

Трансферазы — ферменты переноса. Ферменты этой группы катализируют перенос частей молекул или атомных группировок от одних соединений к другим. Известно много таких ферментов; их различают по тем группам, перенос которых они катализируют.

Наиболее важное значение в обмене веществ имеют фосфотрансферазы и аминотрансферазы.

Фосфотрансферазы (киназы) катализируют перенос остатков фосфорной кислоты с одного вещества на другое.

Большинство реакций переноса фосфатных групп про­текает с участием аденозинтрифосфата (АТФ) и аденозин-дифосфата (АДФ). Эти реакции имеют большое значение, благодаряим осуществляется перенос энергии с одного ве­щества на другое.

Из приведенной ниже формулы видно, что АТФ — высокоэнергетическое соединение; оно имеет одну простую связь (-) и две макроэргические ("богатые энергией"), обо­значаемые значком (~). При гидролизе обычной фосфатной связи освобождается 8,4*10³-12,6*10³ Дж на грамм-моле­кулу отщепленного фосфата, а при гидролизе макроэргической связи — около 4,2*10⁴ Дж.

Фосфотрансферазы участвуют в процессах дыхания и брожения.

Аминотрансферазы — ферменты, осуществляющие реакции переаминирования, т. е. межмолекулярный перенос аминогруппы (-NH₂) с аминокислот на кетокислоты. Эти фер­менты обладают специфичностью. Аминотрансферазы — двухкомпонентные ферменты, в состав кофермента входит витамин В₆. В обмене веществ они играют большую роль, участвуют в образовании новых аминокислот в клетке.

Гивролазы. К гидролазам относятся ферменты, катали­зирующие процессы расщепления и синтеза сложных орга­нических веществ по типу гидролитических реакций с учас­тием воды. Большинство гидролаз являются однокомпонент­ными ферментами.

Гидролазы подразделяют на подгруппы в зависимости от вещества, на которое они действуют.

Карбогидразы — это ферменты, катализирующие гид­ролиз и синтез глюкозидов, ди-, три- и полисахаридов.

Примерами карбогидраз, расщепляющих дисахариды, широко распространенных у микроорганизмов, служат:

мальтаза (α-глюкозидаза) — расщепляет мальтозу (со­лодовый сахар) на две молекулы глюкозы;

сахараза (инвертаза, β-фруктофуранозидаза) — расщеп­ляет сахарозу на глюкозу и фруктозу;

лактаза (β-галактозидаза) — расщепляет молочный са­хар (лактозу) на галактозу и глюкозу.

Из гидролаз, действующих на полисахариды, наиболь­шее значение имеют следующие;

амилазы — ферменты, катализирующие гидролиз крах­мала. Известно три типа амилаз: α-амилаза, β-амилаза и глюкоамилаза. Они различаются свойствами и способом дей­ствия на крахмал. Амилазы находятся в мицелиальных гри­бах и многих бактериях; дрожжи не содержат амилаз;

целлюлоза — фермент, гидролизующий целлюлозу (клет­чатку).

Пектолитические ферменты — это комплекс ферментов (протопектиназа, пектинэстераза, полигалактуроназа), гидролизующих протопектин и растворимый пектин с обра­зованием метилового спирта, галактуроновых кислот, пентоз, гексоз.

Пектолитические ферменты имеются у многих плесе­ней и у некоторых бактерий.

Пептидазы (протеолитические ферменты) катализиру­ют гидролиз белков, пептидов, расщепляя пептидные связи.

Пептидазы обладают специфичностью, каждая пептидаза разрывает пептидные связи между определенными аминокислотами.

Дезаминазы и амидазы — ферменты, катализирующие гидролитическое расщепление аминокислот и амидов с от­щеплением азота в виде аммиака.

Эстеразы — ферменты, катализирующие реакции рас­щепления и синтеза сложных эфиров (эстеров). Они широко распространены у микроорганизмов. Важную роль в обмене веществ микроорганизмов играют липазы. Липазы — это фер­менты, вызывающие гидролиз жиров на глицерин, и высоко­молекулярные жирные кислоты.

Лиазы. К классу лиаз относятся ферменты, которые ка­тализируют реакции негидролитического расщепления орга­нических веществ, сопровождаемые отщеплением от суб­страта тех или иных химических групп; СО₂, НдО, МНд.

Альдолаза — фермент, обратимо расщепляющий шести­углеродную молекулу фруктозодифосфат на два трехуглеродных соединения: фосфодиоксиацетон и фосфоглицериновый альдегид. Этот фермент участвует в начальной стадии пре­вращения сахара в процессе дыхания и брожения.

Декарбоксилазы — ферменты, катализирующие декар-боксилирование (отщепление СО₂) органических кислот.

Во многих микроорганизмах содержится, например, пи-руватдекарбоксилаза, катализирующая отщепление СО₂ от пировиноградной кислоты с образованием уксусного альде­гида. В состав кофермента этой декарбоксилазы входит ви­тамин В₁.

Декарбоксилазы аминокислот участвуют в отщеплении СО₂ от аминокислот с выделением аминов.

Микроорганизмы, Особенно гнилостные бактерии, бо­гаты декарбоксилазами аминокислот.

Изомеразы. Ферменты этого класса осуществляют пре­вращение органических соединений в их изомеры — внут­римолекулярное перемещение радикалов, атомов, атомных группировок.

К этому классу относятся следующие:

триозофосфатизомераза — катализирует взаимное превращение фосфотриоз; фосфодиоксиацетона и фосфо-глицеринового альдегида;

глюкозофосфатизомераза — катализирует обратимое превращение глюкозо-6-фосфат во фруктозо-6-фосфат.

Оба эти фермента участвуют на первых стадиях пре­вращения сахара в процессах дыхания и брожения.

Лигазы (синтетазы). В этот класс входят ферменты, катализирующие реакции синтеза сложных органических соединений из более простых. Эти реакции требуют затраты энергии и обычно протекают одновременно с расщеплением пирофосфатной (макроэргической) связи в АТФ. Примерами таких ферментов могут служить:

карбоксилазы – катализируют при участии АТФ при­соединение углекислого газа к органическим кислотам;

глутаминсинтетаза и аспарагинсинтетаза — фермен­ты синтеза глутамина и аспарагина из NН₃ и соответствую­щих аминокислот с участием АТФ.

Лигазы играют большую роль в углеводном и азотном обмене микроорганизмов.

Использование микробных ферментов

Человек издавна использовал ферментативную активность микроорганизмов. Широкое применение микроорганизмов в пищевых производствах основано на использовании их фер­ментативной деятельности в перерабатываемом пищевом сы­рье. Культуры микроорганизмов можно заменять их фермен­тами, выделив их в виде препаратов из клеток или культуральной среды.

Использование микроорганизмов для получения фермен­тов имеет ряд преимуществ по сравнению с растительным и животным сырьем:

микроорганизмы обладают богатым "ассортиментом" ферментов; среди них есть такие, которые отсутствуют у

животных и в растениях;

микроорганизмы быстро размножаются и в течение ко­роткого времени дают огромную массу клеток, из которых (или из культуральной среды) можно выделить большое

количество фермента;

микроорганизмы растут на относительно дешевых суб­стратах, например, на отходах различных промышленных

производств;

управлять развитием микроорганизмов при современной аппаратуре таких производств значительно легче и проще, чем выращивать растения и животных.

В настоящее время во многих отраслях народного хо­зяйства ферменты микробного происхождения вытесняют ферменты растительного и животного происхождения.

Отечественное производство микробных ферментных препаратов в последние годы интенсивно развивается. В на­стоящее время десятки различных ферментов в виде инди­видуальных ферментных белков и технических препаратов разной степени очистки производятся в промышленном мас­штабе с использованием культур плесневых грибов, бакте­рий, дрожжей.

Ферментный препарат отличается от фермента тем, что содержит помимо белка различные балластные вещества. В настоящее время ферментные препараты довольно широко применяют в пищевой промышленности. Так, препараты гриб­ных амилолитических ферментов используют при производстве этилового спирта из крахмалосодержащего сырья вме­сто зернового солода; в пивоварении — в целях частичной замены солода несоложенным (не подвергавшимся прорас­танию) ячменем; в хлебопекарной промышленности — вза­мен солода при изготовлении заварного ржаного хлеба; до­бавляют грибные амилазы и в пшеничное тесто. Поскольку в этом препарате помимо амилазы имеются, хотя и в не­большом количестве, другие ферменты (мальтаза, пептидазы), процесс изготовления теста ускоряется: увеличиваются объем и пористость хлеба, улучшаются его внешний вид, аромат, вкус. С помощью грибной глюкоамилазы получают глюкозную патоку и кристаллическую глюкозу из крахмала.

Пектолитические грибные ферментные препараты ис­пользуют в соко-морсовом производстве и виноделии. В ре­зультате разрушения пектина этими ферментами ускоряет­ся процесс выделения сока, увеличивается его выход, улуч­шаются фильтрация и осветление соков.

Ферментные препараты, содержащие микробные пептидазы, применяют для повышения стойкости (предохране­ния от белкового помутнения) вина и пива; в сыроделии — взамен (частично) сычужного фермента. Целесообразно ис­пользовать микробные пептидазы для размягчения мяса, ускорения созревания мяса и сельди, получения из отходов рыбной и мясной промышленности пищевых гидролизатов и в других технологических процессах переработки животно­го и растительного сырья. В легкой промышленности их при­меняют при обработке кож, тканей, мехов, льна; в сельс­ком хозяйстве — при приготовлении различных видов кор­мов для животных. В медицине и медицинской промышлен­ности ферменты используют в виде лечебных препаратов, при обработке сырья, предназначенного для лекарственных веществ и других целей.