Робота 11

Виділення суміші пігментів листка. Дослідження фізико-хімічних властивостей пігментів

Пігменти – сполуки, які вибірково поглинають світло у видимій частині спектра. У вищих рослин вони поділяються на три класи: хлорофіли, каротиноїди та фікобіліни. За допомогою пластидних пігментів здійснюється перетворення енергії сонячного світла в хімічну енергію молекул АТФ і НАДФ*Н у світловій фазі фотосинтезу. Більшість клітин фотосинтезуючих організмів містить два типи хлорофілів – хлорофіл а та хлорофіл b (зелені рослини), окрім цього трапляється хлорофіл с (бурі та діатомові водорості), хлорофіл d (червоні водорості). Фотосинтезуючі клітини, які не виділяють кисню, містять лише бактеріохлорофіл або бактеріородопсин; іноді – і той, і інший. Допоміжними пігментами фотосинтезу є каротиноїди (жовті, оранжеві та червоні) – поліненасичені вуглеводи терпенового ряду. До каротиноїдів належать каротини, ксантофіли і каротиноїдні кислоти. Фікобіліни – червоні і сині пігменти деяких водоростей, локалізовані у спеціальних структурах – фікобілісомах. Їхня складна молекула утворена білком і розгорнутим ланцюгом тетрапірола (хромофора). Одна молекула білка може зв’язувати кілька хромофорних груп. Серед фікобілінів розрізняють сині – фікоціаніни, червоні – фікоеритрини та аллофікоціанін.

Для вивчення фізико-хімічних властивостей пігментів здійснюють їх виділення із рослинного матеріалу та розділення. Водночас, враховують, що хлорофіл і каротиноїди не розчиняються у воді, а фікобіліни – розчиняються. Для повнішого виділення пластидних пігментів користуються полярними розчинниками – етиловим спиртом, ацетоном, оскільки ці пігменти зв’язані з ліпопротеїдним комплексом мембран тилакоїдів.

Різна розчинність хлорофілів, каротину та ксантофілів у етиловому спирті та петролейному ефірі є основою методу розділення цих пігментів за Краусом. При перемішуванні спиртового витягу пігментів із петролейним ефіром вони розподіляються між двома шарами розчинників: спиртом, який розміщується внизу, і петролейним ефіром чи бензином, який знаходиться зверху. Отримують дві фази – верхню – неполярну, в якій знаходитимуться хлорофіли і каротин, та нижню – полярну, в якій містяться ксантофіли.

Наявність у молекулі хлорофілу ефірних зв’язків визначає її здатність до гідролізу. При взаємодії з лугом відбувається утворення солі хлорофілінової кислоти та двох спиртів – фітолу та метанолу:

Хлорофіл має здатність до флуоресценції, тобто до світіння після поглинання ним видимого й ультрафіолетового світла. В темряві хлорофіл знаходиться в основному стані з найбільш низьким енергетичним рівнем валентних електронів. Під впливом світла один із електронів молекули хлорофілу переходить у збуджений стан, у якому перебуває протягом короткого проміжку часу, і знову повертається на попередній енергетичний рівень. Цей перехід електрона супроводжується витратою енергії збудження, в т. ч. і на флуоресценцію. Хлорофіл флуоресціює тільки в червоній області спектра, тобто флуоресцентне випромінювання характеризується більшою довжиною хвилі, ніж поглинуте світло-індуктор. Це зумовлено частковим розсіюванням енергії у формі тепла. Хлорофіл сильно флуоресціює в розчинах і слабо в листках, що можна пояснити тісною упаковкою молекул у тилакоїдах, а також використанням поглинутої енергії на фотохімічні процеси.

Сонячна радіація з довжиною хвиль 400-700 нм, яку поглинають пігменти фотосинтезуючих органів рослин, має назву фотосинтетично активної радіації (ФАР). Пігменти поглинають видиме світло вибірково, кожен з них має свій характерний спектр поглинання. Пропускаючи світло через розчин конкретного пігменту, а потім розкладаючи його за допомогою призми спектроскопа виявляють у певних місцях спектра темні смуги, що відповідають спектру поглинання. Оптичні властивості пігментів визначаються особливостями їх хімічної структури. Система кон’югованих подвійних зв’язків у молекулах хлорофілів і каротиноїдів визначає поглинання синьо-фіолетових променів. Наявність магнію в ядрі молекули хлорофілу і гідровані зв’язки між атомами вуглецю в положенні 7 і 8 четвертого пірольного кільця визначають поглинання червоних променів. Хлорофіли мають два максимуми поглинання – в ділянці синього світла (Хл а – 420 нм та Хл b – 455 нм) і червоного (Хл а – 662 нм, Хл b – 644 нм) світла. Каротиноїди поглинають світло в синьо-фіолетовій ділянці спектра (α-каротин – 420 нм, 440 нм, 470 нм; β-каротин – 425 нм, 450 і 480 нм; лютеїн – 425нм, 445 і 475 нм).

У молекулах хлорофілів, які є магній-порфіринами, атом магнію порівняно слабко утримується в порфіриновому ядрі й у разі впливу сильних кислот легко заміщується двома протонами. Утворюється феофітин-порфіриновий пігмент бурого кольору.

Утворення феофітину можна спостерігати в природних умовах: після осіннього приморозку змінюють колір листки та квіти жоржин.

Унаслідок взаємодії феофітину з солями певних металів (оцтовокислий цинк чи мідь) два атоми водню можуть зворотно заміщуватися атомом відповідного металу:

Цинк (мідь)-порфірини, як і магній-порфірини, теж мають зелений колір, проте дещо іншого відтінку.

Мета роботи: ознайомитися з фізико-хімічними властивостями хлорофілів та каротиноїдів.

Прилади і матеріали дослідження: спектроскоп; водяна баня; ножиці; фарфорова ступка з товкачиком; лійка; фільтр; сухі пробірки; штатив; гумові корки; CaCO₃; 96%-ний етиловий спирт; петролейний ефір; сухий NaOH; 10%-ний розчин HCl; оцтовокисла мідь та цинк; зелене листя рослин.

Хід виконання роботи

І. Отримання витягу пігментів

Ножицями нарізають 1 г листя і переносять у фарфорову ступку. До подрібненого листя додають трохи (на кінчику скальпеля) CaCO₃ для нейтралізації клітинного соку і розтирають до гомогенної маси. Потім поступово доливають 20 мл етилового спирту і продовжують розтирати доти, поки спирт не забарвиться в інтенсивний зелений колір. Одержану суміш фільтрують через складений фільтр у суху пробірку та використовують для подальших робіт. Для порівняння таке ж листя розтирають з водою. Порівнюють забарвлення гомогенатів.

ІІ. Розділення пігментів за методом Крауса

У пробірку наливають 2 мл спиртової витяжки пігментів, 3 мл петролейного ефіру або бензину, 2-3 краплі води для кращого розділення. Закривають пробірку корком, збовтують 2 хв і ставлять у штатив для розділення фаз. Спостерігають і зарисовують розподіл пігментів.

ІІІ. Омилення хлорофілу

До суміші пігментів додають грудочку NaOH, струшують. Проводять розділення за методом Крауса. Спостерігають за перерозподілом пігментів. Зарисовують результати спостереження. Сіль хлорофілінової кислоти зберігає зелене забарвлення й оптичні властивості хлорофілу, проте втрачає гідрофобні властивості. Тому при розділенні за методом Крауса вона з верхнього шару переміщується у нижній – спиртовий.

IV. Флуоресценція хлорофілу

Пробірку із спиртовим витягом хлорофілу розглядають проти світла на рівні очей. Вона має смарагдово-зелений колір. Потім пробірку розміщують на темному фоні і розглядають з того боку, з якого на неї падає світло. У відбитому світлі, внаслідок флуоресценції, спиртовий витяг матиме вишнево-червоний колір.

V. Оптичні властивості пігментів

Спектроскоп встановлюють так, щоб усі ділянки спектра мали однакову яскравість. При пропусканні білого світла через спиртовий витяг пігментів, нерозділений і розділений методом Крауса, виявляють спектри поглинання жовтих і зелених пігментів.

Зарисовують отримані спектри, звертають увагу на ширину кольорових смуг. Роблять висновок про спектри поглинання хлорофілів і каротиноїдів.

VI. Отримання феофітину та зворотне заміщення атома водню атомом металу

1. До 2-х мл спиртового витягу пігментів додають 2 краплі HCl, злегка збовтують і спостерігають зміну кольору витягу із зеленого до бурого.

2. Далі половину витягу переливають в іншу пробірку, до однієї додають кристалик оцтовокислої міді, до другої – оцтовокислого цинку. Обережнонагрівають на водяній бані. Спостерігають за відновленням зеленого кольору в обох пробірках.

VII. Роблять загальний висновок про досліджені фізико-хімічні властивості пігментів.