Робота 13

Фотометричний метод кількісного визначення пігментів

Фотометричні методи (фотометрія, колориметрія, спектрофотометрія) дають можливість визначати концентрацію речовини у забарвленому розчині за величиною поглинання монохроматичного світла. Практичне використання здатності речовини поглинати світлову енергію ґрунтується на законах Бугера-Ламберта-Бера: поглинання монохроматичного світлового потоку прямо пропорційне до числа молекул поглинаючої речовини, тобто концентрації. Вимірюючи інтенсивність поглинання світлового потоку досліджуваним розчином, отримують величину, яка називається оптичною густиною розчину (D) або екстинцією (Е). Для визначення концентрації, яка відповідає певній оптичній густині, будують калібрувальний графік, де на осі абсцис відкладають значення концентрації стандартного розчину і його кількох відомих розведень, а на осі ординат – оптичну густину цих розчинів. Отримують калібрувальну криву у вигляді прямої лінії, або наближеної до прямої. Знаючи оптичну густину досліджуваного розчину знаходять його концентрацію за показами калібрувальної кривої. Часто для визначення концентрацій розчинів за оптичною густиною користуються стандартними формулами.

Фотометричні методи придатні і для визначення концентрації та вмісту пігментів у рослинних тканинах, оскільки ці сполуки завдяки особливостям будови молекул мають різні максимуми поглинання в області видимого світла.

Мета роботи:ознайомитися з фотометричним методом кількісного визначення пігментів.

Прилади і матеріали дослідження: фотоколориметр КФК-3; торзійна вага, фарфорові ступки з товкачиками, фільтри, мірні колби на 25 мл; фільтри, лійки, пробірки на 10 мл, 80%-ний ацетон, листки зелених рослин.

Хід виконання роботи

1.Наважку свіжого рослинного матеріалу (0,3-0,5 г) добре розтирають у фарфоровій ступці з невеликою кількістю крейди у 80%-ному ацетоні (2-3 мл). Після настоювання (2-3 хв) екстракт фільтрують. Екстракцію пігментів продовжують невеликими порціями чистого розчинника на фільтрі аж до повного виділення пігментів: останні порції фільтрату, зібрані у пробірку, мають бути безбарвними.

2.

MАцетон, бензол, петролейний ефір є легкозаймистими та отруйними речовинами! Вдихання їх випарів є небезпечним. Використовуйте витяжну шафу для приготування розчинів. Після контакту зі шкірою добре змити водою з милом!

Ацетон при вдиханні накопичується в організмі. Оскільки він виводиться повільно, можливі хронічні отруєння (ГДК 200 мг/м³). Токсична дія бензолу також проявляється при вдиханні випарів (ГДК 20 мг/м³).

Якщо реактив розлився, його слід негайно зібрати, провітрити приміщення і добре відмити місце від залишків. Для цього слід одягнути гумові рукавиці й, якщо є, респіратор.

3.Екстракти кількісно переносять в мірну колбу на 25 мл і об’єм витягу доводять до мітки чистим ацетоном. Отриманий витяг містить суміш зелених і жовтих пластидних пігментів.

4.Для кількісного визначення пігментів частину отриманого екстракту наливають у кювету фотоколориметра (10 мм). Іншу кювету заповнюють чистим ацетоном (контроль). Визначають оптичну густину витягу при відповідних довжинах хвиль – 665 нм, 649 та 440 нм (максимуми поглинання хлорофілу a, хлорофілу b та каротиноїдів, відповідно).

5.Концентрації пігментів розраховують за формулами*:

С_а=11,63·D₆₆₅ – 2,39·D₆₄₉ (мкг/мл);

С_b=20,11·D₆₄₉ – 5,18·D₆₆₅ (мкг/мл);

C_a+b=6,45^.D₆₆₅+17,72^.D₆₄₉ (мкг/мл);

С_карот.=4,695·D₄₄₀ – 0,268·С _a+b (мкг/мл).

*Якщо витяг пігментів отримували за допомогою інших розчинників (100%-ний ацетон, 96%-ний спирт), то вимірювання проводять при інших довжинах хвиль відповідно до формул, наведених у додатку.

6.Після встановлення концентрації пігменту у витягу, визначають його вміст у дослідному матеріалі, враховуючи об’єм витягу і масу зразка:

V – об’єм витягу пігментів у мл;

Р – наважка рослинного матеріалу в г;

А – вміст пігменту в рослинному матеріалі в мкг/г маси сирої речовини.

У нормі вміст хлорофілу листків коливається в межах 500-3000 мкг/г маси сирої речовини, при співвідношенні хл а/хл b =2,5-3,0.

7.Дані заносять у таблицю:

8.Висновок.