Качественное обнаружение активности пероксидазы и каталазы в слюне.

Цель занятия: ознакомить студентов с основными принципами обнаружения активности ферментов. Качественными реакциями установить наличие пероксидазы и каталазы в слюне.

Теория вопроса. Каталаза (КФ1.1.11.6) и пероксидаза (КФ1.1.11.7) отно­сятся к классу оксидоредуктаз, катализирующих окислительно-восстановительные реакции. Ферменты каталаза и пероксидаза являют­ся антиоксидантами, так как обеспечивают прямое обезвреживание кислорода. Ферменты каталаза и пероксидаза принимают участие во всех биохимических процессах, поддерживая нормальный уровень обмена перекиси водорода, которая из-за своей токсичности не должна накапливаться в клетках. Каталаза и пероксидаза избирательно катализируют разрушение перекиси водорода, восстанавливая ее до двух молекул воды. К пероксидазам относятся ферменты, катализирующие окисление субстрата с помощью перекиси водорода.

_{пероксидаза}

Н₂О₂+АН₂ 2Н₂О+А

Слюнная пероксидаза (СПО) катализирует окисление тиоционатов путем расщепления перекиси водорода с образованием гипотиоционатов, которые оказывают антимикробное действие. Образовавшийся гипотиоционат оказывает в 10 раз более мощное антибактериальное действие, чем Н₂О₂. При спонтанном распаде Н₂О₂ образует реакционные формы кислорода: гидроксидный радикал супероксидный анионрадикал. Эти реакционные формы кислорода и гипотиоционат совместно воздействуют на ненасыщенные жирные кислоты, белки, нуклеиновые кислоты, что приводит к образованию продуктов свободно-радикального окисления, нарушению структур клеток и их гибели.

Таким образом, биологическая роль СПО в полости рта заключает-

ся в том, что с одной стороны продукты окисления тиоционатов ингибируют рост и метаболизм лактобацилл и некоторых других микроорганизмов, а с другой стороны предотвращают аккумуляцию Н₂О₂ многими видами стрептококков полости рта.

Под влиянием пероксидазы могут окисляться фенолы, полифенолы, в том числе бензидин. От субстратов под действием пероксидазы переносятся электроны на перекись водорода. Образуются окисленный субстрат и вода. Пероксидазы относятся к геминовым ферментам: в состав их простетической группы входит гем. Пероксидаза содержится почти во всех растительных и животных клетках. В организме человека и животных гемоглобин, миоглобин и цитохромы обладают слабой пероксидазной активностью. Об этой активности можно судить по изменению окраски бензидина. Окисленный бензидин приобретает зеленую окраску, постепенно переходящую в бурую.

Ход работы: В одну пробирку наливают 5 капель 1% раствора бензидина, 4-5 капель 3% раствора перекиси водорода, затем добавляют 5 капель слюны. Наблюдают изменение окраски. Окисленный бензидин приобретает зеленую окраску, переходящую в бурую.