Обнаружение кофермента НАД в слюне и дрожжах.

Цель занятия: изучить коферменты ферментов слюны. Качественными реакциями обнаружить НАД-зависимые дегидрогеназы в слюне и дрожжах.

Теория вопроса. Многие ферменты для проведения каталитической активности нуждаются в присутствии определенных веществ непептидной природы - кофакторов.В качестве кофакторов выступают ионы металлов, производные витаминов В₁, В₂, В₆, РР и нуклеотиды.

Фермент, содержащий кофермент, называют холоферментом,а белковую часть такого фермента - апоферментом.Взаимодействие кофермента с апоферментом отличается высокой специфичностью.

В реакциях, катализируемых НАД-зависимыми дегидрогеназами, в качестве кофермента участвует никотинамидадениндинуклеотид (НАД).

НАД встречается во многих органах и тканях человека и животных, много его в дрожжах и меньше в слюне. Окисленные и восстановленные формы НАД обладают разными спектрами поглощения в УФ области, что и используют для качественного и количественного определения НАД. Этот кофермент легко извлекается из дрожжей горячей водой (он термостабилен) и может быть обнаружен по образованию флюоресцирующего комплекса с ацетоном. Значительно меньше его содержание в слюне.

Ход работы:

1. К 1 мл слюны добавляют 5 капель ацетона и 2 капли 30% NaOH. Через 5 минут добавляют 1 каплю фенолфталеина и по каплям добавляют концентрированную соляную кислоту до обесцвечивания фенолфталеина. Пробирку встряхивают и на 2 минуты помещают в кипящую водяную баню, затем охлаждают и наблюдают слабую синюю флюоресценцию.

2. В пробирку помещают кусочек дрожжей величиной 4-5 г, добавляют 1/3 пробирки воды и кипятят 20-30 сек, не допуская выбрасывания жидкости, отфильтровывают в пустую пробирку 5-10 капель полученного экстракта, добавляют туда 3-5 капель ацетона и 1-2 капли 30% раствора гидроксида натрия. Оставляют пробирку стоять 2 минуты, затем добавляют 1 каплю раствора фенолфталеина и по каплям добавляют концентрированную соляную кислоту до обесцвечивания фенолфталеина. Пробирку в процессе добавления кислоты встряхивают. Помещают пробирку на 2 минуты в кипящую водяную баню, после чего вынимают, охлаждают и наблюдают синюю флюоресценцию.

Контрольные вопросы:

1. Слюна проточная, смешанная. Формирование слюнного секрета.

2. Защитные системы полости рта. Иммуноглобулины слюны. Строение IgA, функция.

3. Биологическое значение определения НАД-зависимых дегидрогеназ.

Тесты: 4, 34, 60,62, 76, 87.

Литература: 4,6, 10, 33, 34

III. Тема: Ферменты слюны.