Предмет и задачи биохимии. История развития биохимии.

Биологическая химия – наука, которая изучает химический состав и химические процессы, лежащие в основе жизнедеятельности организма. Биохимия изучает молекулярные основы жизни. Основные достижения науки начинаются с 50-х годов ХХ века и продолжаются до настоящего времени. Эти достижения заключаются в следующем:

Ø выяснены химические основы ряда важнейших биологических процессов;

Ø установлены функции важных биологических молекул;

Ø определены общие пути превращения молекул и общие принципы, лежащие в основе разнообразных проявлений жизни;

Ø выяснены многие аспекты регуляции метаболизма;

Ø выделены главные органеллы живых клеток и установлены их функции;

Ø получен в чистом виде ряд ферментов и изучен механизм их действия;

Ø накоплено значительное количество данных о механизме действия гормонов;

Ø установлены механизмы образования и использования энергии в клетке;

Ø выяснены особенности строения и функции мембран;

Ø установлены биохимические основы значительного числа болезней;

Ø расшифрованы многие механизмы функционирования клеточного генома, нашедшие применение в практическом здравоохранении.

Биохимия связана с физикой, химией, механикой, математикой, кибернетикой и другими науками, которые снабжают биохимию необходимыми высокоочищенными реактивами и препаратами, рекомендуя новые физико-химические методы исследования, необходимые приборы для их выполнения. Развитие физиологии и гигиены основано на достижениях биохимии. С учетом биохимических данных решаются проблемы сельского хозяйства: повышение урожайности с/х культур, увеличение производства продуктов животноводства, вопросы использования удобрений и средств защиты растений от вредителей. Знания биохимии необходимы для развития пищевой, кожевенной, текстильной промышленности. Основными задачами являются:

1. изучение химического состава живых организмов;

2. изучение химических процессов, процессов обмена веществ, лежащих в основе жизнедеятельности организма;

3. изучение структуры питательных веществ, их переваривания и всасывание в организме.

Полное понимание на молекулярном уровне всех химических процессов связанных с жизнедеятельностью клетки можно решить, если выделить из клетки соединение, определить его структуру и установить функцию.

В истории биохимии можно выделить 4 периода. С древних времен и до эпохи Возрождения (ХVв.) длился I период истории биохимии. В то время человек использовал биохимические процессы (изготовление сыра, пива, вина, табака, хлеба и т.д.).

Во II периоде (до середины ХIХ века) шло накопление знаний по химии живой материи. Немецкий врач Парацельс более 400 лет назад высказал точку зрения, актуальную и сегодня. Он полагал, что в основе жизнедеятельности организма лежат химические процессы и для лечения болезней необходимо использовать химические средства. В 1814 году в России К. Кирхгоф описал ферментативный процесс расщепления крахмала, а в 1828 году немецкий химик Вёлер получил химическим путем мочевину – вещество, которое содержится в крови и моче человека и животных.

III период завершается в 40-50-х годах ХХ века. Биохимия сформировалась как наука. В 60-е годы XIX создаются кафедры медицинской, а затем биологической химии. В 1869 году врач Мишер открывает нуклеиновые кислоты, в 1880 году Лунин Н.И. получает первые данные о витаминах. Благодаря исследованиям А.Я. Данилевского, М.М. Монассеиной, И.П. Павлова в России, братьев Бюхнеров и Либиха в Германии получает новое направление учение о ферментах. В 1902 году Фишер в Германии впервые искусственно синтезировал пептиды и разработал пептидную теорию строения белков. К середине ХХ века установлены основные пути превращения белков, углеводов и липидов в живой клетке, появилось новое направление в биохимии – биоэнергетика. В 1937 году Браунштейн и Крицман в России открыли ферментативный процесс переаминирования аминокислот, в 1939-1942 годах Н.А. Энгельгардт и М.Н. Любимова изучили АТФ-азную активность актина и миозина – главных сократительных белков мышц

IV период – период важнейших открытий в биологии. Использование физико-химических и математических методов позволило выявить молекулярные основы хранения и передачи генетической информации, механизмов биосинтеза белка, изучить структуру и функцию мембран, гормонов и др. Величайшее открытие американскими учеными Уотсоном и Криком пространственной структуры ДНК позволило понять функцию этой молекулы, а на основе этого возникла новая наука – молекулярная биология. В 1967 году синтезируется ДНК вируса, в 1970 г – искусственный ген, в 1966 г – химиоосмотическая теория окислительного фосфорилирования и др.

В настоящее время биохимические исследования широко проводятся в лабораториях развитых стран мира. Остается еще много проблем, которые предстоит решить биохимии в ближайшее время. (Мало известны механизмы развития и дифференцировки клеток; примитивны знания в области механизмов деления клеток; практически неизвестны химические основы психической деятельности человека, механизмы секреции и т.д.)

Биохимики пользуются большим арсеналом методов исследования. Элементарной ячейкой жизни является клетка. Она главный объект исследований и материал для исследования. К изучению клетки как материала для исследования биохимия пришла не сразу. В начале объектом исследования служили интактные животные. Такой метод позволил открыть ряд важнейших соединений – витаминов, аминокислот, липидов – незаменимых в питании организмов соединений. Удаление отдельных органов и наблюдения за изменениями в целом организме позволили выяснить роль этих органов. После разработки методов и искусственного хранения удалось изучить особенности отдельных процессов, специфичных для этих органов. Этому способствовало внедрение методов, использующих тонкие срезы органов и культивирование клеток (метод клеточных культур).

Одновременно с экспериментами на животных проводились обширные исследования с использованием микроорганизмов. Чтобы проследить за превращениями какого-либо соединения в организме в классической постановке эксперимента, исследователь вынужден был вводить большое количество исследуемого вещества из-за недостаточно высокой чувствительности методов выделения промежуточных продуктов его обмена. Количество вводимого вещества обычно намного превышало физиологическую норму, что оказывало влияние на результаты и выводы были недостаточно точны. Эту проблему удалось решить, используя изотопный метод.

Изотопный метод – позволяет изучить обмен отдельных веществ. Различают 2 вида изотопов: стабильные изотопы, которые входят в состав природных соединений в небольшом количестве, и радиоактивные изотопы, получаемые искусственно, на ядерных реакторах. Радиоактивные изотопы используются в радиоавтографии, которая позволяет указать место локализации изотопа в клетке, на хроматограмме и т.д. Для этой цели после введения изотопа и проведения исследования полученный материал накладывают на пленку, покрытую чувствительной фотоэмульсией. Испускаемые при распаде частицы вызывают на пленке почернение, позволяющее обнаружить соединения, меченые изотопом. Например, использование ¹⁵N позволило обнаружить высокую скорость обновления белков в тканях, ³²Р, ³⁵S – помогло изучить процессы обмена фосфора и серы.

В арсенале методов исследования биохимика особое место занимают физико-химические методы (электронная микроскопия; дифференциальное центрифугирование, позволяющее разделить клетку на её составляющие компоненты; разделение веществ на основе их различной в растворимости в растворителях, адсорбции и т.д.).

Наиболее простой метод – экстракция (вытяжка), ее проводят при низкой температуре, физиологических значениях рН и концентрации солей. Для экстракции липидов обычно используют органические растворители.

Экстракты из отдельных тканей выделяют после предварительного разрушения клеток – гомогенизации, которую ведут вручную или при помощи вращающихся в стеклянных сосудах пестиков. Эту процедуру проводят при низкой температуре (0-4ºС). После такой обработки измельченная ткань превращается в гомогенат, который далее подвергают центрифугированию (простое и ультрацентрифугирование). Классический вариант предполагает 3 этапа центрифугирования со все более высокой скоростью. На каждом этапе соответственно получают ядерную, митохондриальную и микросомальную фракции. Для получения более чистых фракций, помимо обычного центрифугирования, используют и центрифугирование в градиенте плотности каких-либо соединений. Центрифуги – специальные технические устройства, позволяющие вращать пробирки с большой скоростью. Путем простого центрифугирования получают две фракции: осадок на дне пробирки из более плотных частиц и вторая – жидкая, называемая супернатантом. При ультрацентрифугировании в градиенте плотности вначале пробирку заполняют, например, раствором сахарозы (зональное препаративное ультрацентрифугирование), концентрация которого линейно увеличивается от 5% у верхнего края пробирки до 20% у её нижнего края. При центрифугировании частицы оседают с разной скоростью, образуя отдельные полосы вдоль длины пробирки. В пробирке обычно прокалывают дно и собирают вытекающую жидкость при помощи коллектора по каплям.

При равновесном ультрацентрифугировании используют раствор хлорида цезия, образующий при длительном центрифугировании градиент плотности, на который наносят смесь частиц для разделения. Частицы собирают в поперечные зоны по их плотностям. Полученные фракции можно сразу или после предварительной очистки использовать для дальнейших исследований, которые могут включать анализ структуры или изучение обмена и функций биомолекул.

Анализу структуры должны предшествовать методы выделения и очистки фракций от примесей. Для разделения молекул используют хроматографию и электрофорез:

1. Хроматография – используется для разделения молекул, помещенных в подвижную фазу (жидкость, газ) и перемещаемых вдоль неподвижной фазы (твердые вещества или жидкость). При этом происходит разделение на основе разной адсорбции веществ на неподвижной фазе, разных зарядов разделяемых молекул, разных размеров или разной растворимости в неподвижной фазе. Существует большое число методов хроматографии:

- на бумаге,

- ионообменная,

- тонкослойная,

- газожидкостная,

- гельфильтрация и др.

2.Фракционирование с различными концентрациями солей (высаливание белков и др.).

3.Электрофорез – метод основан на том, что в электрическом поле молекулы веществ, обладающие зарядом, передвигаются с различной скоростью. Так разделяют на фракции белки крови. Разновидности электрофореза:

- высоковольтный на бумаге;

- на агарозе;

- на ацетате целлюлозы;

- на полиакриламидном геле.