Физические методы получения мутантов

Среди физических мутагенов чаще всего используют излучения различного типа. Они бывают двух видов: ионизирующие и неионизирующие.

Ионизирующие излучения. Рентгеновское, гамма- и нейтронное излучения называются ионизирующими за способности превращать атомы и молекулы в электрически заряженные частицы — ионы, т.е. вызывать ионизацию.

Рентгеновское излучениеначали применять первым в мутагене­зе, его используют широко и в настоящее время, поскольку рентге­новские аппараты имеются во многих учреждениях, ими просто управлять, рентгеновским излучением относительно легко воздей­ствовать как на семена, так и на другие части растений, несложно менять дозы облучения.

Источником гамма-излучения обычно служит радиоактивный кобальт ("Со) или цезий ('"Cs). На объект воздействуют двумя спо­собами обработки: острым (мощное кратковременное излучение) и хроническим (длительное, но значительно более слабое).

Нейтронное излучение возникает в результате ядерных реакций. В частности, при делении ядер урана и плутония. Различают быст­рые нейтроны (энергия ионообразования 0,2-26 МэВ) и медлен­ные, или тепловые (энергия 0,0025 эВ). Быстрые нейтроны оказы­вают мутагенное воздействие преимущественно в момент облуче­ния, тепловые — вызывают наведенную радиоактивность в самой клетке. Относительная биологическая эффективность нейтронов в 10-40 раз выше, чем гамма- и рентгеновского излучения.

Радиоактивные изотопы. В качестве мутагенных факторов мож­но применять также радиоактивные изотопы фосфора ("Р) и серы ("S), у которых период полураспада составляет соответственно 14,3 и 87,1 дня. Частота появления мутации зависит от дозы облучения. Однако эта пропорциональная зависимость наблюдается только в интервале 100%-ной выживаемости. С переходом в интервал от ЛДд до ЛД,дд (ЛДц — порог выживаемости, ЛДдд — гибель всех растений) пропорциональность нарушается за счёт гибели облучаемых расте­ний. За критическую обычно принимают такую дозу, при воздей­ствии которой выживает 30-40 % растений (ЛДц).

Неионизирующие излучения. Генетически эффективным неиони­зирующим излучением считается ультрафиолетовое (УФ). Оно имеет большую длину волны (200-400 нм), чем ионизирующие излуче­ния, и меньшую энергию. При его воздействии происходит не иони­зация вещества, а только возбуждение молекул. Проникающая спо­собность УФ очень мала, его используют только для обработки пыль­цевых зерен.

Лазерное излучение также производит мутагенный эффект. Пока­зано, что при воздействии на семена и вегетирующие растения им­пульсным и непрерывным (в том числе и низко интенсивным) ла­зерным излучением видимой области спектра можно получить вы­сокий выход мутантных форм (Ю. Гужов и др., 1991).

Первые опыты по использованию рентгеновских лучей для вызывания мутаций у лесных древесных пород были проведены В.Н. Сукачевым на ивах в 1933 г. Облучались черенки (более 5000), семена и цветки. Им было установлено, что большие дозы облучения без­вредны для черенков и детальны для семян. При этом сильные до­зировки даже стимулировали рост побегов и черенков. По резуль­татам опытов с облучением черенков были описаны две мутации по листьям: узколистость и курчавость, обнаруженные у четырех ви­дов ивы. В эти же годы И. Никитиным установлено стимулирую­щее влияние рентгеновских лучей на всхожесть семян березы и со­сны и прорастание пыльцы липы.

В 50-х годах М.А. Кудинов в Белоруссии провел большое многолетнее исследование по изучению влияния ионизирующих излуче­ний на лесные растения. В опытах изучено 49 видов лесных и деко­ративных деревьев и кустарников. Установлены стимулирующие прорастание семян дозы и летальные. Показана очень высокая радиоустойчивость семян у некоторых кустарников. Так, ракитник русский и барбарис амурский имели повышенную всхожесть семян при их облучении 60000 рад. Хвойные породы, особенно ель обык­новенная, имели низкую всхожесть уже при 100 и 200 рад.

Г.Ф. Привалов (1965, 1968, 1974) проводил облучение семян y- и рентгеновскими лучами. Им установлены критические дозы облу­чения для 30 видов древесных растений. Наиболее радиочувстви­тельными оказались семена хвойных (сосна сибирская, лиственни­ца, сосна, ель), березы и ольхи. Для этих видов растений критичес­кие дозы (ЛД) лежат в пределах 2-6 кР. Наиболее устойчивыми (критическая доза более 20 кР) оказались семена облепихи, гледичии, тополя. В результате опытов не только с семенами, но и с рас­тениями получен ряд мутантных форм.

Ф.Л. Щепотьевым в Донецком ботаническом саду выведены многочисленные мутанты дуба, тополя, каштана конского, биоты восточной, шиповника, айвы японской, облепихи и других пород. Мутанты плодоносят, в результате чего получено второе поколение у дуба черешчатого при обработке гамма-лучами Со⁶⁰ дозами от 10³ до 6-10³ рад выделены мутантные формы по характеру крон и особенностям роста: плакучая, пирамидальная, флаговидная, чаше­видная, стелющаяся, карликовая, кустарниковая, быстрорастущая. Рост некоторых опытных растений дуба в семилетнем возрасте пре­вышал контрольные по высоте и диаметру в 2-3 раза. У клена се­ребристого после облучения семян гамма-лучами дозами 579, 1158 и 1544 рад в 10-летнем возрасте выделены следующие формы: До­нецкий ботанический — пестро-золотистая декоративная форма, пу­шистый, плакучий с поникающими ветвями и разрезно-узколопастными листьями, краснолистный. У тополя волосистоплодного в результате облучения черенков гамма-лучами дозами 50-150 рад выделен пестролистный мутант — Донецкий золотой. При облуче­нии гамма-лучами Со⁶⁰ шиповника получены следующие результа­ты. Дозы облучения от 3 до 10 кР стимулировали всхожесть, а высо­кие дозы (18-21 кР) понижали ее. Выделены мутанты с различной крупностью плодов, формой листьев, повышенным содержанием аскорбиновой кислоты в плодах и масла в семенах, а также расте­ния без шипов на побегах и листьях (Ф. Л. Щепотьев, 1982).

Таким образом, работы с физическими мутагенами показали возможность их использования в практических целях для получения декоративных и быстрорастущих форм лесных древесных пород.

5.2.3. Химические методы получения мутантов

Химические мутагены по их действию делят на пять классов:

• ингибиторы азотистых оснований, входящих в состав нукле­иновых кислот; их действие заключается в подавлении синтеза гуа­нина и тимина;

• аналоги азотистых оснований, входящие также в нуклеино­вые кислоты; они включаются в ДНК на место тимина;

• алкилирующие соединения, вызывающие нарушение точно­сти авторепродукции молекул ДНК;

• окислители, восстановители и свободные радикалы, вызыва­ющие замену в молекуле ДНК пар оснований А-Т на Г-Ц;

• акридиновые красители, образующие в результате реакции с ДНК комплекс, препятствующий нормальной редупликации.

Наиболее распространенными и широко используемыми в пос­ледние десятилетия в России являются алкилирующие соединения, в частности супермутагены. К ним относятся этиленимин (ЭЙ), диэтилсульфат (ДЭС), диметилсульфат (ДМС), нитрозоэтилмочевина (НЭМ), нитрозометилмочевина (НММ) и др.

Чувствительность растений к мутагенам можно оценивать по энергии прорастания и всхожести семян, выживаемости растений, энергии роста, частоте и спектру хромосомных нарушений в пер­вом митозе в клетках проростков. Для получения наибольшего ко­личества полезных мутаций рекомендуется брать концентрации близкие к критическим.

Химические мутагены применяют в виде водных растворов раз­личной концентрации (обычно 0,01-0,2% в течение 18-24 ч) или в газовой фазе. Чаще воздействию подвергают различные вегетатив­ные органы — семена, черенки, почки и т. п. Недостатком этого способа воздействия являются частое возникновение химерных ра­стений, содержащих мутантные и немутантные ткани, и невысокая эффективность из-за гибели обработанного материала, особенно при средних и жестких концентрациях, что ведет к потере значи­тельного количества мутаций.

Эффективность действия мутагенов зависит от многих факто­ров, в частности: особенностей генотипа, способа воздействия, вида мутагена, его концентрации (дозы) и экспозиции, кислотности и температуры раствора, обрабатываемого органа, его физиологичес­кого состояния в момент обработки и др. Как и при физических воздействиях, при химической обработке черенки обычно более устойчивы к мутагенам, чем семена. Набухшие семена чувствитель­нее сухих. Генеративные органы чувствительнее вегетативных. Полиплоиды устойчивее диплоидов. Поэтому в каждом конкретном случае оптимальные режимы воздействия подбираются эксперимен­тальным путем. Полезные мутации возникают крайне редко, не бо­лее одной-двух на тысячу мутаций.

Индуцирование химических мутантов лесных древесных пород начало широко применяться в разных регионах с середины 60-х го­дов. В Донецком ботаническом саду Ф.Л. Щепотьевым получены декоративные и быстрорастущие формы дуба черешчатого (стелю­щиеся, плакучие, колонновидные и др.), биоты восточной (с пира­мидальной, яйцевидной, шаровидной и овальной кроной) и других пород. В НИИ лесной генетики в Воронеже Е.М. Гуляевой, О.С. Машкиной и другими сотрудниками получены хемомутанты сосны обык­новенной и тополя бальзамического. У сосны — быстрорастущие, раноплодоносящие, треххвойные, редкохвойные и др. У тополя — быстрорастущие, пирамидальные, плакучие и др. Интересные ре­зультаты с сосной обыкновенной получены Е.Н. Самошкиным в Брянске (Ф.Л. Щепотьев, 1982; О.С. Машкина, 1995; Е.Н. Самошкин, 1986).