Гемиглобинцианидным методами на компараторе цвета

В этом методе цвет гемоглобина, трансформированного в оксигемоглобин или гемиглобинцианид посредством со­ответствующих трансформирующих ра­створов, сравнивается с цветом цветных стеклянных стандартов, расположенных на вращающемся диске компаратора.

Процедура определения гемоглобина состоит в следующем:

1. В пробирке (или кювете) проводится цветная оксигемоглобиновая или гемиглобинцианидная реакция.

2. В компаратор помещается диск с цветными стеклянными стан­дартами, соответствующими методу приготовления цветного ра­створа.

3. Пробирка с цветным раствором помещается в компаратор.

4. Вращая диск, подбирают стеклянный стандарт с цветом, совпадающим с цветом раствора.

5. Значение концентрации считывают в окошке компаратора.

Описанный метод требует точного дозирования 0,02 мл крови, точного дозирования трансформирующих растворов. Погрешность определения цвета обусловлена 9 градациями цветовых стандартов.

Достоинство компаратора в его портативности и отсутствии электрического питания.

ТУРБИДИМЕТРИЯ И НЕФЕЛОМЕТРИЯ

Турбидиметрия и нефелометрия в клинической химии используется в основном для определения индивидуальных белков. Особенностью таких определений является построение калибровочного графика с использованием не менее пяти концентраций, так как калибровочный график имеет нелинейный характер.

Нефелометрия

Сравнивая величины рассеянного и падающего света I и I можно определять концентрацию веществ в растворе. Такой метод исследования называется нефелометрией, а приборы, на которых производят рения — нефелометрами.

6.30. Схема измерения рассеянного света.

А — нефелометр, регистрирующий малоугловое рассеивание, Б — нефелометр, регистрирующий рассеивание под углом 90°, В — турбидиметр.

На рис. 6.30. представлена принципиальная схема измерения рассеянного света. Измерение светорассеивания под разными углами дает информацию о размерах частиц в растворе. В то же время, если известны размеры частиц рассеивающего вещества, то возможно по интенсивности рассеянного света при фиксированном угле измерения определить концентрацию вещества. Методы, основанные на взаимодействии антиген-антитело высоко специфичны, поэтому практически во всех случаях известно, что измеряется. Исходя из этого, приборы для нефелометрии, как правило, программируются под измерение определенных специфических компонентов биологической жидкости, чаще всего индивидуальных белков.

На рис. 6.31. изображена принципиальная схема отечественного нефелометра НФМ.

Свет от лампы разделяется на 2 пучка — один пучок проходит через раствор исследуемого вещества, другой через канал сравнения. В окуляре видны 2 поля: одно — измерительного канала, второе — канала сравнения. Изменяя ширину щели, добиваются равной освещенности полей. Результат получают по калибровочным кривым, связывающим ширину щели и концентрацию вещества. В последнее время в нефелометрах вместо обычных ламп используют лазерные источники излучения. Лазер имеет высокую интенсивность излучения, строгую направленность излучения и строго фиксированную длину волны излучения.

Рис. 6.31. Оптическая схема нефелометра НФМ.

1 — лампа; 2, 11 — светофиль­тры; 3 — стеклянная пластинка, разделяющая свет на 2 пучка; 4 — кювета с раствором исследуемого вещества; 5 — ловушка света; 6 — стеклянный рассеиватель; 7, 7', 9, 9' — линзы, 8, 8' — уравнительные диафрагмы; 10, 10' — ром­бические призмы; 12 — окуляр.

Турбидиметрия

Метод исследования светорассеивающих растворов по прошедше­му через них свету называется турбидиметрией. Для измерения свето­вых потоков используются турбидиметры, построенные по принципу визуальных или электрических фотометров.

При турбидиметрических исследованиях интенсивность прошед­шего светового потока I может быть определена по уравнению:

,

где — интенсивность падающего светового потока; — интенсив­ность потока, прошедшего через раствор; — концентрация рассеиваю­щих частиц в растворе; b — толщина поглощающего слоя раствора; d — средний диаметр рассеивающих частиц; k и — константы, зависящие от природы вещества и метода измерения; — длина войны.

При постоянных b, d, k, и получим:

или

здесь t — молярный коэффициент мутности раствора или турбидность.

В качестве турбидиметра можно использовать большинство фотометров и биохимических анализаторов, так как этот способ не требует особой конструкции прибора.

Рис. 6.32. Турбидиметрия — метод измерения прошедшего через кювету светового потока.

Кривая доза-эффект. (Калибровочный график, отражающий реакцию взаимодействия антигена и атитела)

Реакция антиген-антитело проявляется в растворе в виде образо­вания агрегатов. Схематически реакцию взаимодействия антигенов (Ag) с антителами (At) можно изобразить следующим образом: если при определении антигена ввести в тест-систему постоянное количе­ство антител, то при невысокой концентрации белка (антигена) все антигены связаны с антителами; если образующиеся иммунные ком­плексы осадить центрифугированием, то в супернатанте можно опре­делить несвязанные антитела. Такое явление называется избытком антител или антитело-эксцесс (рис. 8.16 «А»). При увеличении концентрации Ag повышается оптическая плотность.

Рис. 8.16. Схематическая диаграмма формирования преципитата при вза­имодействии антиген-антитело.

А. Избыток антител. Все антигенные сайты (ме­ста связывания) заняты антителами и образование преципитата подавлено. Б. Пропорциональное содержание антигенов и антител. Оптимальная пропор­ция, когда 2—3 молекулы антитела приходится на молекулу антигена. Обра­зуется преципитат. В. Избыток антигенов. Все антитела связаны, образования преципитата не происходит.

Когда концентрация антигенов и антител пропорциональна, происходит связывание всех антител и антигенов, такой комплекс выпадает в осадок в виде преципитата и в супернатанте не определяются антитела и антигены. Такое состояние определяют как эквивалентное (рис. 8.16 «Б»).

При дальнейшем увеличении концентрации антигенов количество антител бывает недостаточным для полного связывания белка. При этом частицы иммунных комплексов становятся мелкими, преципитат практически не формируется. В супернатанте при этом определяются свободные антигены. Такое явление носит название антиген-эксцесс (рис. 8.16 «В»).

В 1929г. Heidelberger и Kendall описали график классической преципиционной кривой. График носит название кривой Хайдельбергеpa-Кендаля (рис. 8.17). Эту кривую можно разделить на 3 зоны:

1) Зона избытка антител: Величина преципитатов увеличивается по мере добавления антигенов, в супернатанте сохраняются свободные антитела;

2) Зона соответствия антигена и антитела: Имеет место максимальная преципитация, супернатант не содержит ни свободных антител, ни свободных антигенов;

3) Зона избытка антигенов: Из-за высокой концентрации антигенов формируются небольшие иммунные комплексы, а не преципитат, супернатант содержит свободные антигены.

Такая форма кривой характерна практически для всех методов иммунопреципитации, включая иммунотурбидиметрию и иммунонефелометрию, и рассматривается в этих методах как кривая доза-эффект.

Рис. 8.17. Кривая доза-эффект при образовании комплексов антиген-антитело в иммунохимической реакции (кривая Хайдельбергера-Кендаля).

Для практических измерений необходимо, чтобы регистрация проводилась на восходящем участке кривой доза-эффект, этот участок используется в качестве калибровочного графика (стандартной кривой) (рис. 8.16).

Рис. 8.16. Калибровочный график, характерный для определения индивидуальных белков турбидиметрическим и нефелометрическим методами.

Для построе­ния графика требуется, по крайней мере, 5 стандартных растворов антигена.

Калибровочная кривая строится для каждого индивидуального белка, для каждого прибора, при любом изме­нении условий регистрации и периоди­чески по мере проведения исследова­ний.