ПРАВИЛА ПОЛЬЗОВАНИЯ ФАРМАКОПЕЙНЫМИ СТАТЬЯМИ 7 страница

Метод с использованием стандартного образца является более точным и надежным. Возможность применения значения удельного показателя поглощения в каждом конкретном случае следует обосновывать. Обычно метод с использованием значения удельного показателя поглощения применим при допусках содержания анализируемого вещества не менее +/- 10% от номинального содержания.

Многокомпонентный спектрофотометрический анализ

Многокомпонентный спектрофотометрический анализ (анализ смесей) применяют для одновременного количественного определения нескольких компонентов лекарственных средств, каждое из которых подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера.

Количественное определение в многокомпонентном спектрофотометрическом анализе основывается обычно на использовании уравнения:

m

А = SUM E x c i = 1,...n, (5)

i j = 1 ij j

где:

А - оптическая плотность испытуемого раствора при i-ой длине волны;

i

E - показатели поглощения (зависящие от способа выражения

Ij

концентрации) j-го компонента образца при i-ой аналитической длине волны;

c - концентрация j-го компонента образца.

j

Соответствующие методики проведения анализа и расчетные формулы указываются в частных фармакопейных статьях.

Производная спектрофотометрия

В производной спектрофотометрии исходные спектры поглощения (нулевого порядка) преобразуются в спектры производных первого, второго и более высокого порядков.

Спектр первой производной представляет собой график зависимости градиента кривой поглощения (скорость изменения оптической плотности с длиной волны, d A/d лямбда) от длины волны.

Спектр второй производной представляет собой график зависимости

2 2

кривизны спектра поглощения (d А/d лямбда ) от длины волны. Вторая

производная при любой длине волны связана с концентрацией следующим

соотношением:

2 1%

2 d A

d A 1 см

--------- = ---------- x c x l, (6)

2 2

d лямбда d лямбда

где:

A - оптическая плотность при длине волны лямбда;

1%

A - удельный показатель поглощения при длине волны лямбда;

1 см

c - концентрация вещества в растворе, в граммах/100 мл;

l - толщина слоя, в сантиметрах.

Производная спектрофотометрия может быть использована как для целей идентификации веществ, так и их количественного определения в многокомпонентных смесях, а также в тех случаях, когда имеется фоновое поглощение, вызванное присутствием веществ, содержание которых не регламентируется.

Приборы. Используют спектрофотометры, отвечающие указанным выше требованиям и оснащенные аналоговым резистентно-емкостным дифференцирующим модулем или цифровым дифференциатором, или другими средствами получения производных спектров, в соответствии с инструкцией к прибору. Некоторые методы получения спектров второй производной приводят к смещению длин волн относительно исходного спектра, что следует учитывать там, где это необходимо.

Разрешающая способность. Если указано в частных фармакопейных статьях, записывают спектр второй производной для раствора 0,2 г/л толуола в метаноле, используя метанол в качестве раствора сравнения. На спектре должен присутствовать небольшой отрицательный экстремум, расположенный между двумя большими отрицательными экстремумами при 261 нм и 268 нм, в соответствии с рис. 12.1.1. (не приводится). Если нет других указаний в частных фармакопейных статьях, отношение A/B должно быть не менее 0,2.

Методика. Процедура анализа аналогична применяемой в обычной спектрофотометрии, но вместо оптических плотностей используют производные. Готовят раствор испытуемого образца, настраивают прибор в соответствии с инструкцией производителя и рассчитывают количество определяемого вещества, как указано в частной фармакопейной статье.

Рис. 12.1.1. Спектр второй производной раствора

толуола (0,2 г/л) в метаноле

Рисунок не приводится.

12.2. СПЕКТРОМЕТРИЯ В ИНФРАКРАСНОЙ ОБЛАСТИ

(ОФС 42-0043-07)

Инфракрасные (ИК) спектры (колебательные спектры) возникают вследствие поглощения электромагнитной энергии при колебаниях ядер атомов в молекулах или ионах, которые сопровождаются изменением дипольных моментов, и представляют собой зависимость пропускания от длины волны (лямбда) или частоты колебаний (ню).

Под ИК-областью подразумевают электромагнитное излучение в области длин

волн от 0,78 до 400 мкм. Область от 780 до 2500 нм (от 0,78 до 2,5 мкм)

рассматривается как ближняя ИК-область, область от 2,5 до 25 мкм (от 4000

-1

до 400 см ) относится к средней ИК-области спектра и область от 25 до 400

мкм относится к дальней ИК-области. Наиболее часто используется средняя

ИК-область.

Длину волны (лямбда) в ИК-спектрах обычно измеряют в микрометрах

(микронах), мкм.

Поскольку частота колебаний в ИК-спектрах имеет большие числовые

_

значения, обычно используют не частоты (ню), а волновые числа (ню),

-1

которые измеряются в см и связаны с частотой (n) уравнением:

_

ню = ню/с,

где:

-1

ню - частота, в герцах (с );

-1

с - скорость света в вакууме, в см x с .

_

Волновое число (ню) связано с длиной волны (лямбда, в мкм)

соотношением:

_ 4

(ню) = 10 /лямбда.

Приборы. Могут быть использованы инфракрасные спектрофотометры, снабженные оптической системой (призмы или дифракционные решетки), выделяющей монохроматическое излучение в измеряемой области, или спектрофотометры с Фурье-преобразованием. В последних используется полихроматическое излучение и рассчитывается спектр в заданной области частот путем Фурье-преобразования исходных данных. В таких приборах вместо диспергирующего прибора используется интерферометр, а обработка спектральных данных производится с помощью компьютера.

Подготовка образца. Для записи спектра пропускания или поглощения готовят образец субстанции по одной из следующих методик.

Жидкости. Жидкости исследуют в форме пленки между двумя пластинками, прозрачными для инфракрасного излучения, или в кювете с малой (обычно 0,01-0,05 мм) толщиной слоя, также прозрачной для инфракрасного излучения.

Жидкости или твердые вещества в растворе. Готовят раствор испытуемой субстанции в подходящем растворителе. Выбирают концентрацию вещества и толщину слоя кюветы, позволяющие получить удовлетворительный спектр.

Обычно хорошие результаты получают при концентрациях от 5 до 15 г/л при толщине слоя от 0,1 до 1 мм.

Поглощение растворителя компенсируют путем помещения в канал сравнения аналогичной кюветы, содержащей выбранный растворитель.

Кюветы. Если кюветы, заполненные растворителем, обладают разным поглощением при выбранной длине волны, то вносят поправку на измеренное поглощение испытуемого раствора. При использовании спектрофотометров с Фурье-преобразованием коррекция кювет не требуется, поскольку одна и та же кювета может быть использована и для растворителя и для испытуемого раствора. Кюветы для ИК-спектрометрии изготавливают из солевых материалов (NaCl, KBr, CaF2, LiF и др.). Область прозрачности кюветы в ИК-области зависит от использованного материала.

Растворители. Не существует растворителей, которые при значительной

толщине слоя были бы полностью прозрачными для ИК-спектров.

Четыреххлористый углерод (при толщине слоя до 5 мм) практически прозрачен

-1

до 6 мкм (1666 см ). Углерода дисульфид (толщиной 1 мм) подходит как

-1

растворитель до 40 мкм (250 см ) за исключением областей от 4,2 до 5,0 мкм

-1 -1

(от 2381 до 2000 см ) и от 5,5 до 7,5 мкм (от 1819 до 1333 см ), где он

имеет сильное поглощение. Другие растворители прозрачны в относительно

узкой области. Растворители, применяемые в ИК-спектрометрии, должны быть

инертны к материалу, из которого сделана кювета.

Твердые вещества. Твердые вещества исследуют в твердом состоянии (диски из галогенидов щелочных металлов), диспергированными в подходящей жидкости в виде суспензии или формируют пленку из расплавленной массы между двумя пластинами, прозрачными для инфракрасного излучения. Подготовку образца описывают в частной фармакопейной статье.

Диски. 1-3 мг вещества, предназначенного для испытания, растирают с 150-200 мг, если не указано иначе в частной фармакопейной статье, тщательно измельченного и высушенного калия бромида или калия хлорида (обычно используют калия бромид). Типичные условия высушивания калия бромида: при 105 град. C в вакууме, в течение 12 ч. Обычно такого количества достаточно для приготовления диска диаметром 13 мм и получения спектра подходящей интенсивности. Смесь тщательно перетирают, добиваясь необходимой однородности, и прессуют диск при давлении около 800 МПа (8 т/кв. см) в вакууме (2-3 мм рт. ст.) в течение 2-5 мин. Причиной образования некачественных дисков могут быть такие факторы, как недостаточное или чрезмерное растирание, влага или иные примеси в дисперсионной среде и недостаточное измельчение частиц.

Диск непригоден для испытания, если при визуальном осмотре он

-1

неоднороден по прозрачности или если его пропускание при 2000 см (5 мкм)

составляет менее 75% без компенсации при отсутствии специфической полосы

поглощения.

Суспензии. Небольшое количество вещества, предназначенного для испытания, растирают с минимальным количеством вазелинового масла или другой подходящей жидкости (смешивают 5-20 мг твердого вещества с 1-2 каплями иммерсионной жидкости). Полученную суспензию сжимают между двумя пластинками (NaCl или KBr), прозрачными для инфракрасного излучения.

Газы. Газы исследуют в кювете, прозрачной для инфракрасного излучения, с длиной оптического пути около 100 мм. Откачивают воздух из кюветы и заполняют анализируемым газом через кран или при помощи игольчатого клапана.

Если необходимо, доводят давление в кювете до атмосферного, используя газ, прозрачный для инфракрасного излучения (например, азот или аргон). Для исключения помех, связанных с поглощением воды, углерода диоксида или других атмосферных газов, в канал сравнения помещают идентичную кювету, которая либо вакуумирована, либо заполнена газом, прозрачным для инфракрасного излучения.

Для записи спектра по методу нарушенного полного внутреннего отражения (МНПВО) подготовку образца проводят одним из способов.

Растворы. Вещество растворяют в соответствующем растворителе, соблюдая условия, приведенные в частной фармакопейной статье. Раствор испаряют на поверхности элемента МНПВО, который обычно изготавливают из кристалла бромида йодида таллия (KRS-5), германия или другого минерала с большим показателем преломления.

Твердые вещества. Вещество помещают на поверхность элемента МНПВО таким образом, чтобы получить гомогенный контакт.

Идентификация с использованием стандартных образцов

Образец испытуемого вещества и стандартный образец готовят по одной и

-1

той же методике и записывают спектры в области от 4000 до 400 см (от 2,5

до 25 мкм), в одних и тех же условиях. Полосы поглощения в спектре

испытуемого образца должны соответствовать по положению полосам поглощения

в спектре стандартного образца. Под полосами поглощения подразумевают

минимумы пропускания и максимумы поглощения.

Если спектры, полученные в твердом состоянии, показывают различия в положении полос поглощения, то испытуемую субстанцию и стандартный образец обрабатывают одним и тем же способом так, чтобы они кристаллизовались или получались в одной и той же форме, или обрабатывают способом, указанным в частной фармакопейной статье, а затем снимают спектры.

Идентификация с использованием эталонных спектров

Контроль разрешающей способности. Записывают спектр пленки полистирола

толщиной 0,04 мм. Разность x (рис. 12.2.1 - не приводится) между процентом

-1

пропускания при максимуме пропускания А при 2870 см (3,48 мкм) и минимуме

-1

пропускания B при 2849,5 см (3,51 мкм) должна быть больше 18. Разность у

-1

между процентом пропускания при максимуме пропускания C при 1589 см (6,29

-1

мкм) и минимуме пропускания D при 1583 см (6,32 мкм) должна быть больше

12.

Проверка шкалы волновых чисел. Шкала волновых чисел может быть

проверена с помощью пленки полистирола, которая имеет минимум пропускания

-1

(максимум поглощения) при волновых числах (в см ), приведенных в табл.

12.2.1.

Методика. Субстанцию готовят к испытанию в соответствии с инструкцией,

прилагаемой к эталонному спектру. Используя условия, при которых

проводилась проверка разрешающей способности, записывают спектр испытуемого

-1

образца и на него накладывают полосы полистирола при 2849,5 см (3,51

-1 -1

мкм), 1601,2 см (6,25 мкм) и 1028,3 см (9,72 мкм). Сравнивают два

спектра (эталонный и спектр испытуемой субстанции) и полосы полистирола,

указанные выше. При использовании положения полос полистирола в качестве

стандартных величин, положения значимых полос в спектре испытуемой

субстанции и в эталонном спектре должны соответствовать друг другу в

пределах 0,5% от шкалы волновых чисел. Относительная величина полос обоих

спектров должна согласовываться между собой.

Рис. 12.2.1. Типичный спектр полистирола,

используемый для проверки разрешающей способности

Рисунок не приводится.

Таблица 12.2.1

Минимумы пропускания и допустимые пределы для

пленки полистирола

┌───────────────────────────────────┬─────────────────────────────────────┐

│ -1 │ -1 │

│ Минимумы пропускания, см │ Допустимые пределы, см │

├───────────────────────────────────┼─────────────────────────────────────┤

│ 3060,0 │ +/- 1,5 │

├───────────────────────────────────┼─────────────────────────────────────┤

│ 2849,5 │ +/- 1,5 │

├───────────────────────────────────┼─────────────────────────────────────┤

│ 1942,9 │ +/- 1,5 │

├───────────────────────────────────┼─────────────────────────────────────┤

│ 1601,2 │ +/- 1,0 │

├───────────────────────────────────┼─────────────────────────────────────┤

│ 1583,0 │ +/- 1,0 │

├───────────────────────────────────┼─────────────────────────────────────┤

│ 1154,5 │ +/- 1,0 │

└───────────────────────────────────┴─────────────────────────────────────┘

Примеси в газах

Для анализа примесей в газах используют кювету, прозрачную для инфракрасного излучения и имеющую соответствующую длину оптического пути (например, от 1 до 20 м). Кювету заполняют так, как указано в разделе "Газы". Для обнаружения и количественной оценки примесей используют методики, указанные в частных фармакопейных статьях.

12.3. АТОМНО-ЭМИССИОННАЯ И АТОМНО-АБСОРБЦИОННАЯ

СПЕКТРОМЕТРИЯ (ОФС 42-0044-07)

Атомная спектрометрия - эмиссионная и абсорбционная - применяется для определения содержания элемента в испытуемом образце посредством измерения интенсивности одной из эмиссионных линий атомного пара (атомно-эмиссионная спектрометрия) или поглощения излучения атомным паром (атомно-абсорбционная спектрометрия) определяемого элемента путем измерения интенсивности эмиссии (испускания) или абсорбции (поглощения) света при определенной длине волны атомного пара элемента, генерированного из вещества, например, при введении раствора вещества в пламя. Определение проводят при длине волны, соответствующей выбранной эмиссионной или абсорбционной линии.

Точность обоих методов атомной спектрометрии, в зависимости от концентрации вещества, составляет 1-4%, чувствительность определяется свойствами аналитической линии, составом пробы, классом аппаратуры и может достигать 0,001 мкг/мл.

АТОМНО-ЭМИССИОННАЯ ПЛАМЕННАЯ СПЕКТРОМЕТРИЯ (АЭС)

Принцип метода. Анализируемый раствор распыляется в виде аэрозоля в пламя горелки, работающей на горючем газе. Под действием температуры пламени происходит ряд сложных физико-химических процессов: испарение растворителя из капель аэрозоля, испарение твердых частиц, диссоциация молекул, возбуждение атомов и возникновение характеристического излучения атомов. Излучение определяемого элемента отделяется от постороннего с помощью светофильтра или монохроматора, попадает на фотоэлемент и вызывает фототок, который измеряется. Количественное определение элемента методом эмиссионной спектрометрии основано на функциональной зависимости интенсивности спектральной линии (I) от концентрации элемента в растворе (c). Прямопропорциональная зависимость между I и c имеет место лишь в определенной для данного элемента области концентраций. Линейную зависимость I от c может нарушать самопоглощение, ионизация, образование газообразных или трудно диссоциирующих в пламени соединений.

Прибор. Главными составными частями атомно-эмиссионного спектрометра являются: генератор атомного пара определяемого элемента (пламя, плазма, дуга и др.), монохроматор и детектор.

Если генератором является пламя, в качестве растворителя для приготовления испытуемого и стандартного растворов рекомендуется использовать воду. Могут использоваться и органические растворители, если они не влияют на стабильность пламени.

АТОМНО-АБСОРБЦИОННАЯ СПЕКТРОМЕТРИЯ (ААС)

Принцип метода. Резонансное излучение от лампы с полым катодом проходит через пламя, в которое распыляется анализируемый раствор пробы. Излучение попадает на входную щель монохроматора, установленного таким образом, что из спектра выделяется только резонансная линия определяемого элемента, интенсивность которой измеряется фотоэлектрическим способом. Измеряют уменьшение интенсивности резонансной линии вследствие поглощения ее атомами определяемого элемента, принимая интенсивность неослабленной линии за 100%. Величина поглощения резонансного излучения пропорциональна числу атомов, находящихся в поглощающем слое.

Прибор. Главными составными частями прибора являются: источник излучения, атомный генератор определяемого элемента (пламя, печь и др.), монохроматор и детектор - для считывания сигнала из нагревательной камеры.

Для каждого определяемого элемента должен быть выбран специфический источник, излучающий спектральную линию, которая должна быть абсорбирована. Таким источником излучения обычно является полая катодная лампа, катод которой испускает излучение при возбуждении. Поскольку излучение, абсорбируемое испытуемым элементом, обычно той же длины волны, что и его линия эмиссии, в полой катодной лампе используется тот элемент, который определяется.

Прибор снабжен аспиратором для введения испытуемого образца в пламя, создаваемое газовыми смесями.

Число возбужденных атомов увеличивается с ростом температуры, которая зависит в основном от теплотворной способности создающего пламя газа (табл. 12.3.1).

Таблица 12.3.1

Температура наиболее часто используемых

газовых смесей

Способ введения образца зависит от типа используемого генератора. Если генератором атомного пара является пламя, в качестве растворителя для приготовления испытуемого и стандартного растворов рекомендуется использовать воду. Могут использоваться и органические растворители, если они не влияют на стабильность пламени. При использовании печи может быть также использована техника ввода твердых проб.

В атомно-абсорбционной спектрометрии должна учитываться природа растворителя и концентрация твердых частиц. Идеальным считается растворитель с минимальными помехами в процессах поглощения или эмиссии, при использовании которого в пламени образуются нейтральные атомы. Если имеются значительные различия между поверхностным натяжением или вязкостью испытуемого раствора и стандартного раствора, то эти растворы всасываются и атомизируются с различной скоростью, что обуславливает существенное различие в генерированных сигналах. Концентрация кислоты в растворах также влияет на процессы абсорбции. Таким образом, растворители, используемые для приготовления испытуемого и стандартного растворов в методе ААС, должны быть одними и теми же или максимально похожими и должны образовывать растворы, которые легко всасываются через трубку форсунки аспиратора.

Присутствие в растворе частиц нерастворенного твердого вещества может вызвать помехи при проведении анализа, поэтому общее содержание нерастворимых твердых частиц в растворах должно быть менее 2%.

Атомный пар может быть получен также вне спектрометра, например, методом "холодного пара" для определения ртути или гидридным методом. При определении ртути атомы генерируются при химическом восстановлении, и атомный пар вносится потоком инертного газа в абсорбционную ячейку, расположенную на оптическом пути прибора. В гидридном методе получают гидрид определяемого элемента, который либо смешивается с газом, питающим горелку, либо вносится инертным газом в нагретую абсорбционную ячейку, где он диссоциирует на атомы.

Методика. Прибор выводят на режим в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора и устанавливают требуемую длину волны. В генератор атомного пара вводят холостой раствор и настраивают регистрирующее устройство на нулевое значение в случае атомно-эмиссионного спектрометра и на максимальное светопропускание в случае атомно-абсорбционной спектрометрии. Вводят стандартный раствор определяемого элемента с наибольшей концентрацией и подбирают чувствительность для получения подходящего значения регистрируемого сигнала.

Испытуемый раствор готовят, как указано в частной фармакопейной статье.

Определения проводят путем сравнения со стандартными растворами известной концентрации определяемого элемента одним из двух методов: методом калибровочной кривой или методом стандартных добавок.

Каждый раствор вводят в генератор прибора не менее трех раз и записывают установившееся показание. Каждый раз промывают прибор холостым раствором и проверяют, чтобы показание прибора возвращалось к первоначальному значению для холостого раствора.

В случае использования печи в качестве генератора атомного пара между измерениями ее отжигают.

Метод калибровочной кривой. Готовят не менее трех стандартных растворов определяемого элемента таким образом, чтобы ожидаемое значение концентрации испытуемого раствора находилось внутри диапазона концентраций стандартных растворов. Все реагенты, используемые при приготовлении испытуемого раствора, прибавляют к стандартным растворам и холостому раствору в таких же концентрациях.

Строят калибровочную кривую зависимости среднего значения результата измерения (I), полученного для стандартных растворов, от концентрации (c) и определяют концентрацию элемента в испытуемом растворе по калибровочной кривой.

Метод стандартных добавок. Равные объемы испытуемого раствора помещают не менее, чем в три мерные колбы одинаковой вместимости. Во все колбы, кроме одной, прибавляют пропорционально увеличивающиеся объемы стандартного раствора, содержащего известную концентрацию определяемого элемента (стандартные добавки), и доводят объемы растворов используемым растворителем до метки. При этом значение регистрируемого сигнала растворов со стандартными добавками должно находиться в линейной области калибровочной кривой.

Рассчитывают параметры линейного уравнения прямолинейной зависимости среднего значения результата измерения от концентрации раствора методом наименьших квадратов и вычисляют концентрацию определяемого элемента в испытуемом растворе.

Расчет концентрации может быть произведен графическим методом. Для этого строят график зависимости среднего значения результата измерения от добавленного количества определяемого элемента. Экстраполируют линию, соединяющую эти точки на графике, до пересечения с осью абсцисс. Расстояние от начала координат до полученной точки пересечения дает концентрацию определяемого элемента в испытуемом растворе.

При использовании техники ввода твердых проб условия проведения анализа должны быть указаны в частной фармакопейной статье.

При использовании АЭС и ААС для определения концентрации элемента в анализируемых образцах наряду с приведенными выше методами (калибровочной кривой и стандартных добавок) могут быть использованы метод сравнения и метод ограничивающих растворов или другие валидированные методы.

Реактивы и эталонные растворы. Вода должна быть деионизированной на ионообменных смолах, продистиллированной непосредственно перед употреблением и должна соответствовать требованиям, предъявляемым к воде очищенной.