Технология микроклонального размножения.

Обязательное ус­ловие клонального микроразмножения — использование объек­тов, полностью сохраняющих генетическую стабильность на всех этапах процесса, от экспланта до растений в поле. Такому требо­ванию удовлетворяют апексы и пазушные почки органов стебле­вого происхождения, т. е. меристематические ткани. Их устойчи­вость к генетическим изменениям, вероятно, связана с высокой активностью систем репарации ДНК, а также с негативной се­лекцией измененных клеток.

Процесс клонального микроразмножения можно подразделить на 3 этапа:

1. Получение хорошо растущей стерильной культуры. На этом этапе необходимо правильно выбрать растение-донор, получить свободную от инфекции культуру, добиться ее выживания и быс­трого роста на питательной среде.

2. Собственно размножение, осуществляемое несколькими спо­собами:

· активизация пазушных меристем;

· индукция образования адвентивных почек тканями листа, стеб­ля, чешуйками и донцем луковиц, корневищем и зачатками соцве­тий без первоначального образования каллусной ткани;

· микрочеренкование побега, сохраняющего апикальное доми­нирование;

· стимуляция образования микроклубней и микролуковичек;

· индукция соматического эмбриогенеза.

3. Подготовка к высадке в поле или к реализации. Это очень важный этап, во время которого в теплице укорененные расте­ния, полученные in vitro, адаптируют к новым условиям внешней среды: проводят закаливание растений, повышают их устойчи­вость к патогенным микроорганизмам и различным неблагопри­ятным факторам внешней среды. Существует много различных способов адаптирования растений к пересадке in vivo. Это под­бор почвенного субстрата, создание определенной влажности, обработка химическими веществами (глицерин, парафин) для предотвращения обезвоживания листьев. Некоторые древесные ра­стения лучше приживаются, если их заразить in vitro микоризообразующими грибами. Упрощенный спо­соб адаптации пробирочных растений винограда был разработан в Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН. Адап­тацию проводят прямо в пробирках, снимая с них пробки, когда растения винограда дорастают до верха пробирки. Через 1,5—2 недели, когда верхушки побега с двумя развитыми листьями по­являются над пробиркой, растение готово к пересадке в почву. Для предотвращения механических повреждений корневой систе­мы растение пересаживают в почву вместе с агаром, заглубляя его так, что над поверхностью почвы остаются только 2 развитых листа, которые выросли из пробирки и уже адаптировались к вне­шним условиям. Такая методика позволяет значительно упростить, ускорить и удешевить этап акклиматизации растений.

Клональное микроразмножение растений проводят разными способами. Первый и основной способ — активизация пазушных меристем. Он состоит в снятии апикального доминирования и активизации развития меристем, существующих в растении. Этот способ основной и в обычном вегетативном размножении. И на интактном растении, и в случае клонирования снятие апикально­го доминирования достигается или удалением апикальной мери­стемы побега, или благодаря действию цитокинина. При клонировании цитокинины (6-бензиламинопурин, 6-фурфуриламинопурин, зеатин) добавляют в питательную среду, что приводит к развитию многочисленных пазушных побегов. Эти побеги отделя­ют от первичного экспланта и культивируют на свежей питатель­ной среде. Активизацию пазушных меристем широко используют в промышленном размножении овощных сельскохозяйственных культур (картофель, томаты, огурцы, сахарная свекла, топинам­бур и др.), цветов (гвоздика, роза, гербера), плодовых и ягод­ных культур (яблоня, вишня, малина, крыжовник и др.), древес­ных растений (туя, можжевельник и др.). Однако бесконечно раз­множать таким способом растения нельзя, поскольку длительное воздействие цитокининов, входящих в состав питательных сред, вызывает аномалии в морфологии стебля, потерю способности побегов к укоренению, иногда — гибель растений. В опытах с размножением земляники было показано, что при микроклональном размножении необходимо чередовать 2—3 цикла получения побегов с их укоре­нением.

Второй способ — индукция развития адвентивных почек, т. е. по­чек, возникающих из растительных клеток и тканей, которые их обычно не образуют. Этот метод в значительной мере обусловлен тотипотентностью клеток. Почти любой орган или ткань расте­ния, свободные от инфекции, могут быть использованы в каче­стве экспланта и в определенных условиях образуют адвентивные почки. Данный процесс вызывают внесением в питательную среду определенных концентраций цитокининов и ауксинов, причем цитокинина должно быть гораздо больше, чем ауксина. Это наи­более распространенный способ микроразмножения высших рас­тений. Развивая адвентивные почки на апикальных и пазушных меристемах, размножают растения томата, лука, чеснока; на сег­ментах листовых пластинок — салат, глоксинию, фиалки; на тка­нях донца луковиц — лук, чеснок, гладиолусы, тюльпаны и дру­гие луковичные растения.

Третий способ — микрочеренкование побега, сохраняющего апикальное доминирование. Растения-регенеранты, полученные любым другим способом, можно черенковать в стерильных усло­виях, высаживать на свежую питательную среду, укоренять, и адаптировать к полевым условиям либо снова подвергать микро­черенкованию для того, чтобы увеличить количество посадочного материала.

Четвертый способ — размножение в биореакторах микроклуб­нями. Это один из способов ускоренного размножения оздоров­ленного материала. О. Мелик-Саркисов сконструировал гидропон­ную установку, позволяющую получать около 7000 микроклубней с 1 м² при массе одного клубня 5 г. Предусмотрена последующая механизированная посадка их в грунт. В отделе биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений им. К.А.Тимиря­зева РАН создана эффективная полупромышленная замкнутая си­стема пневмоимпульсного биореактора для получения микроклуб­ней картофеля, в которой предусмотрена возможность воздействия на направление и скорость процессов клубнеобразования. Техно­логии клонального микроразмножения в биореакторах разработа­ны не только для сельскохозяйственных, но и для декоративных растений (лилии, гладиолусы, гиацинты, филодендроны и т.д.). Однако созданные установки пока носят лабораторный, модель­ный характер.

Пятый способ размножения — образование соматических за­родышей — основан на морфогенных изменениях — соматичес­ком эмбриогенезе. Впервые это явление было отмечено в середине 50-х годовXX в. в культуре клеток моркови. Формирование эмбриоидов в культуре осуществляется в два этапа. На первом сома­тические клетки дифференцируются в эмбриональные в присут­ствии в питательной среде ауксинов, обычно это 2,4-D. На следующей стадии развива­ются эмбриоиды. Этот процесс идет только при значительном снижении концентрации ауксина или полном отсутствии его в питательной среде. Соматический эмбриогенез может происхо­дить в тканях первичного экспланта, в каллусной и суспензионной культурах.

Поскольку соматические зародыши представляют собой пол­ностью сформированные растения, данный метод позволяет со­кратить затраты, связанные с подбором условий укоренения и адаптации растений-регенерантов. Кроме того, преимущество по­лучения соматических эмбриоидов состоит в том, что при исполь­зовании соответствующей техники капсулирования из них можно получать искусственные семена.

Соматический эмбриогенез в настоящее время применяют для размножения пшеницы, ячменя, моркови, редиса, винограда, некоторых древесных растений (дуб, ель, эвкалипт).