Люминесценция и ее применение для изучения динамики белков.

Люминесцентные методы позволяют измерять внутримолекулярную подвижность белка, изучая, как зависит от температуры положение мак­симума люминесценции введенной в белок метки максимума либо соб­ственной люминесценции триптофана белка.

Здесь можно о схеме Яблонского.

Когда переход в возбужденное состояние значительно изменяет электрический дипольный момент молекулы по сравнению с дипольным моментом в состоянии S0, поле диполей окружающей среды также оказывается неравновес­ным. Диполи среды за время жизни молекулы-хромофора в возбужденном состо­янии могут успеть переориентироваться в соответствии с новым полем диполя возбужденного хромофора. Релаксация диполей лимитируется динами­ческими свойствами среды. Если время дипольной релаксации среды тр много больше времени жизни возбуждения хромофора т(тау)*, то релаксация за время т* не успевает произойти, т. е. окружение хромофора жесткое. При тр < т* быстрая дипольная релаксация успевает произойти за время т* суще­ствования возбуждения в молекуле хромофора. Это снижает энергетический уро­вень возбужденного электрона, вызывая сдвиг максимума спектра флуоресценции в длинноволновую сторону.

В сложной системе (белок), где изменение электронного состояния молекулы-хромофора вызывает реорганизацию его микроокружения, время релаксации среды может быть больше времени жизни электронного возбуждения (тр > т*). Этого не наблюдается в отдельных молекулах-хромофорах, где внутримолекулярная колебательная релаксация занимает 10-12- 10-11 с.

Изменяя релаксационные свойства среды (при изменении температуры), можно влиять на соотношение между тр и т*. Это находит свое отражение в положении максимума лямбдашах спектра флуоресценции. Таким методом можно получить ценную информацию о подвижности бел­ков, изучая собственную флуоресценцию триптофана. Индол триптофана характеризуется большим изменением момента перехода при возбуждении (до 4D). Поэтому положение максимума его спектра флуоресцен­ции сильно зависит от подвижности диполей среды и может варьировать до 30 нм. Так как т* для 5*-состояния триптофана составляет единицы наносекунд, то по этим данным можно судить о структурных перестройках в белке в наносекундном временном диапазоне. Белки обладают характерными двухступенчатыми кривыми зависимости положения спектра флуо­ресценции от температуры в области от —90 до 0°С. Сдвиги полосы флуоресценции на 4 - 9 нм в области от —90 до —20°С и на 5- 12 нм в области от —20 до 0° свидетельствуют о замораживании движений в белковой матрице в наносекундном диапазоне. Высушенные белки не дают этих спектральных сдвигов, что подчер­кивает роль воды как необходимого фактора для появления подвижности белка. Система белок - вода замерзает как единая микрофаза. Если вводить в белок экзогенные фосфоресцирующие метки (например, производные эозина), то таким способом можно оценивать более длинные характер­ные времена структурных перестроек (до 1 с). В глубоких слоях белковых макромолекул происходят медленные движения тp ~ 1 с, а в более поверхностных слоях эти движения существенно быстрее: тp ~ 10- с. Найденные времена характеризуют подвижность только ближайшего микроокружения люминесцирующего хромофора и не могут распространяться на всю макромолекулу. Число и места локализации таких люминесцирующих меток в белке зависят их от химических особенностей и от характера взаимодействия с белковыми группами.

Методы радиоспектроскопии включают главным образом метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) и ядерного магнитного резонанса (ЯМР).

Можно рассказать о ЭПР)

Если вяз­кость в образце мала, то за счет быстрых молекулярных движений взаимные влияния спинов успевают усредниться при поглощении пере­менного поля. В этом случае резонанс наблюдается при усредненной линии с уменьшенной шириной. Наоборот, замораживание раствора и уменьшение его вязкости вновь замедлят молекулярные движения. Тогда при поглощении энергии переменного поля спины успевают почувствовать влияние разных локальных полей в своем микроокружении, что уменьшит время сохранения спинового состояния и вызовет уширение общей линии резонанса. Т. о. измеряя ширину линии погло­щения, можно получить данные о характере внутримолекулярных дви­жений в микроокружении спиновой частицы (радикал, протон). В методе спиновых меток к функциональной группе белка присоединяют свободный радикал, дающий сигнал ЭПР. Характеристики сигнала ЭПР являются показателем подвижности микроокружения этого радикала. Наиболее удобны нитроксильные метки, содержащие свободнорадикальную группу N – О., где неспаренный электрон фактически делокализован между атомами N и О. Сигнал ЭПР этой метки имеет определенную структуру, которая обусловлена влиянием магнитного момента ядра азота на неспаренный электрон наряду с действием на него внешнего магнитного поля. Вращение нитроксильного радикала относительно направления внешнего поля изменяет структуру сигнала ЭПР. Сущест­вуют методы расчета, которые позволяют по параметрам сигнала ЭПР оценить характерное время тс вращения метки. Время вращения метки зависит от глубины ее погружения в слоях белковой глобулы. В наружном водном слое значения тс составляют 10-11 - 10-10 с. Поверхностные слои характеризуются значениями ~ 10-10 - 10-8 с, в глубоких слоях плотного гидрофобного ядра глобулы ~ 10­8 - 10-7 с. Было обнаружено также резкое увеличение ферментативной активности высушенных препаратов реакционных центров фотосинтеза при их увлажнении, которое коррелирует с одновременным падением значений тс спин-метки. Это говорит об изменении динамического со­стояния и одновременном появлении внутримолекулярной подвижности и функциональной активности белка.

Развитие этого метода позволило изучать динамику мембранных белков, белок- белковые и белок-липидные взаимодействия в биологических мембранах.

Так с помощью спектроскопии с переносом насыщения была исследована ди­намика Са-АТФазы в мембранах саркоплазматического ретикулума и протеолипосомах, что позволило выявить связь конформационной подвижности белка с его АТФазной активностью, показать, что внутримолекулярная подвижность и актив­ность Са-АТФазы зависят от природы ассоциированных с этим белком липидов. Исследования, проведенные на фоторецепторных мембранах, позволили обна­ружить как необратимую агрегацию родопсина, возникающую при повреждении светом этих мембран, так и обратимую ассоциацию родопсина, связанную, по всей видимости, с функцией этого белка

Метод ЯМР. Изучение динамики белковых структур методом ЯМР основано на измерении времени релаксации Т1 и Т2 по ширине линии резонанса. Удается найти значения тс для ядер, на которых наблюдается резонанс.

Изучая протонный резонанс, можно оценить подвиж­ность белковых групп, в состав которых входят "резонирующие" прото­ны. Метод ЯМР позволяет изучать определенные виды внутримолекулярного движения в белках. Так, температурные измерения времени Т1 в сывороточном альбумине обнаруживают вращения метильных групп с временами ~ 10-10 с при - 100° наблюдаются более мед­ленные движения ~ 10-8 с (возможно, осцилляции полипептидной цепи). По времени Т2 для протонного резонанса удается определить три характерных диапазона времен тс: медленное вращение глобулы как це­логос ~ 10-5 с), внутренние движенияс ~ 10-5 - 10-6 с), движение внешних наиболее подвижных групп белкас ~ 10-10 с). Метод ЯМР дает важную информацию и о химической структуре молекулы. Она проявля­ется в результате разного влияния локальных полей соседних ядер на положение полосы резонанса отдельных протонов, занимающих различ­ные места в структуре молекулы. Вследствие этого у разных протонов резонанс появляется на разных частотах. Это явление называется химическим сдвигом. Кроме того, структура полосы ЯМР так же, как и в слу­чае ЭПР, отражает тонкие эффекты влияния магнитных моментов ядер, передающиеся через электронные связи в молекуле. Сейчас широко используются данные по резонансу на 31Р, а также на 13С, линии которого находятся в стороне от основной массы перекрывающихся линий. Анализ спектровЯМРдля отдельных сравнительно небольших белков с выделением линий от метильных, метиленовых, SH-групп, остатков триптофана, тирозина, гистидина.

Заметно большее разрешение достигается в спектрах ЯМР для 13С, имеющего более широкий диапазон химических сдвигов по сравнению с протонами. Здесь вы­деляют также отдельные линии карбонильных групп, остатков аланина, аргинина и ряда других. На основе использования двумерной ЯМР спектроскопии удается разделить эффекты, связанные с химическим сдвигом и с косвенным спин-спиновым взаимодействием. Ряд структурно-динамических характеристик может быть получен на основе изучения процессов спиновой диффузии, связанной с тем, что переходы спинов при резонансе индуцируют такие же переходы для соседних спинов в слу­чае частичного или полного перекрывания их резонансных линий. Все это сделало метод ЯМР одним из ведущих методов изучения структуры и динамики биополимеров непосредственно в растворе.

 

Метод ядерной гамма-резонансной (ЯГР) спектроскопии дает важную информацию о динамике белков. В отличие от методов ЭПР и ЯМР он дает не только временные, но и амплитудные характеристики движений в белке. Метод позволяет определять средние величины сме­щений атомов в структуре белка, которые происходят в течение коротких времен 10-7 - 10-9 с. Метод основан на резонансном поглощении у - квантов тяжелым ядром атома, например ядром изотопа Fe, который содержится в природных соединениях в количестве 2,2%. Энергия у-кванта, поглощенного ядром изотопа Fe, составляет ∆Е = 0,0144 мЭв, а время жизни ядра 57Fe в возбужденном состоянии т* ~ 10-7 с. В реальных условиях резонансная частота поглощения у-квантов ядром не совпадает с частотой самого у-кванта. При поглощении у-кванта ядром Fe часть энергии кванта превраща­ется в кинетическую энергию отдачи, т. е. в поступательную энергию движения самого ядра. Это значит, что на самом деле энергия у-кванта, используемая для непосредственного возбуждения ядра 57Fe, будет уменьшена на величину, равную энергии отдачи. В результате резонанс­ная частота поглощения сместится по сравнению с исходной частотой самого у-кванта. Поскольку естественная ширина линии очень мала (Г ~ 10-8 эВ), а энергия отдачи для свободного 57Fe намного больше 2-10-3 эВ, то этот сдвиг будет очень заметен. Реальная величина энергии отда­чи зависит от способности ядра атома 57Fe воспринять импульс отдачи, а это в свою очередь определяется его собственной подвижностью. В твердых телах возможно поглощение у-квантов без отдачи, когда энер­гию отдачи берет на себя весь кристалл в целом, а смещений ядра 57Fe вообще не происходит. Этот эффект поглощения у-квантов без отдачи называется эффектом Мессбауэра. В этом случае в спектрах поглощения у-квантов появляются линии, не смещенные по энергии из-за отсутствия отдачи. С ростом среднеквадратичного смещения х(с чертой)2, мессбауэровского ядра 57Fe вероятность f' поглощения без отдачи у-кванта падает. Наоборот, при малых х(с чертой)2 не происходит передачи энергии ядру, жестко свя­занному с окружением, и вероятность f' приближается к единице.

Зависимость вероятности поглощения без отдачи от х(с чертой)2 носит экспонен­циальный характер:

.

Измеряя вероятность поглощения без отдачи в различных условиях температуры и влажности, можно оценить величину смещения ядра мессбауэровского атома, т. е. получить амплитудную характеристику его подвижности. Нормальный белок обладает характерной температурной зависимостью f ' (Т) с изломом, что говорит о кооперативном характере размораживания внутренней подвижности при температурах излома. Сухой белок такими свойствами не обладает, а скорее напоминает обыч­ное твердое тело, где увеличение х(с чертой)2 с температурой носит монотонный характер. При температурах 77 - 200 К мессбауэровские ядра колеб­лются с малыми амплитудами (0,1 А), а при высоких температурах появ­ляются более крупномасштабные смещения (0,3 - 0,6 А). Увеличение внутренней подвижности белка и в этом случае кор­релирует с соответствую­щим ростом его функциональной активно­сти. Временное разрешение в методе ЯГР лимитируется временем т* возбужденного состояния ядра 57Fe (т* ~ 10-7 с). С помощью метода ЯГР измеряется смещение мессбауэровского ядра, которое атом успевает пройти за время 10 -7 с.

Картинка 3 «Общая классификация под­вижности элементов струк­туры белка по характерным временам отдельных видов движений»

+ картинки «внутримолекулярная подвижность белков» и «движение молекул, времена».

 


<== предыдущая лекция | следующая лекция ==>
Влияние температуры на скорость реакций в биологических системах. | 




Дата добавления: 2016-04-11; просмотров: 1825;


Поиск по сайту:

При помощи поиска вы сможете найти нужную вам информацию.

Поделитесь с друзьями:

Если вам перенёс пользу информационный материал, или помог в учебе – поделитесь этим сайтом с друзьями и знакомыми.
helpiks.org - Хелпикс.Орг - 2014-2024 год. Материал сайта представляется для ознакомительного и учебного использования. | Поддержка
Генерация страницы за: 0.006 сек.