Использование микроорганизмов и ферментных препаратов для гидролиза лактозы

Государственная политика в области здорового питания предусматривает более широкое обеспечение населения продуктами диетического и лечебно-профилактического назначения. Это соответствует концепции оздоровления человека и предупреждения старения организма путем включения в рацион кисломолочных продуктов, сформулированной русским физиологом И.И. Мечниковым. Он первый обратил внимание на антагонистические свойства микрофлоры кисломолочных продуктов по отношению к патогенной микрофлоре. По его мнению, молочнокислые бактерии являются антагонистами вредной микрофлоры, обитающей в желудочно-кишечном тракте человека. При этом субстратом для развития молочнокислой микрофлоры является лактоза, которая трансформируется в молочную кислоту по гомоферментативному (гликолитическому) или гетероферментативному (пентозофосфатному) пути.

При производстве 1 т сыра образуется 9 т сыворотки и пахты. В каждой тонне сыворотки содержится около 5 кг полноценного белка, витамины группы В, комплекс свободных аминокислот, важнейшие минеральные элементы. В 1 т сыворотки содержится около 50 кг молочного сахара - ценнейшего сырья для пищевой и микробиологической промышленности. Лактоза имеет низкую сладость, но при действии на нее лактазы расщепляется на два моносахарида: глюкозу и галактозу.

К продуктам функционального питания относятся и низколактозные молочные продукты, которые обеспечивают полноценное питание людям с лактозной недостаточностью. По данным FAO/WHO более 70 % населения в мире страдает от недостаточности кишечной лактазы, однако абсолютное неусвоение лактозы является большой редкостью. Лица с лактазной непереносимостью (вызванной, главным образом, нарушением обмена веществ и аллергическими реакциями на организм человека) не способны полностью использовать энергию лактозы (30 % энергетической ценности цельного и около 60 % энергетической ценности обезжиренного молока). Это особенно опасно в детском возрасте, поскольку потребность в энергии оказывается существенно неудовлетворенной, и происходит использование белка не на специфические строительные цели организма, а как источника пополнения недостающей энергии. Кроме того очевидным является тот факт, что ослабленные вследствие стресса, сложной экологической обстановки и других неблагоприятных факторов человеческие организмы легче усваивают продукты, подверженные биотехнологической обработке.

При отсутствии в организме лактазы нерасщепленная лактоза достигает толстой кишки, где становится отличной средой для активного роста имеющейся микрофлоры. В результате ее метаболизма появляются желудочно-кишечные расстройства. В этой связи исследования различных аспектов биотрансформации лактозы при получении молочных продуктов специального назначения являются актуальными.

Известно несколько способов удаления лактозы из молочных продуктов: сбраживание молочнокислой микрофлорой до молочной кислоты и других продуктов; разделение молока с освобождением лактозы, затем вновь соединение компонентов; гидролиз лактозы до глюкозы и галактозы (химическим методом, т.е. кислотным гидролизом; энзиматическим, т.е. с использованием свободных растворимых ферментов, находящихся в среде или иммобилизованных; биологическим методом с использованием свободных или иммобилизованных клеток микроорганизмов и комбинированным - сочетание методов обработки молока иммобилизованной b-галактозидазой и ультрафильтрацией). Применяют также методы избирательного удаления лактозы из жидкого молока, например диализом, и экстракция лактозы из сухих молочных продуктов.

В СССР интерес к гидролизу лактозы молочной сыворотки проявлен в 70-х годах ХХ века в Институте биохимии А.Н. Баха. Комплексные исследования по выделению b-галактозидазы (b-D-галактозид-галактогидролаза К.Ф. 3.2.1.23) из наиболее активных ее продуцентов грибов Curvularia inaequalis и дрожжей Saccharomyces fragilis были проведены под руководством А.С. Тихомировой, которая внесла большой вклад в развитие технологии b-галактозидазных препаратов в нашей стране.

Источниками получения лактазы могут служить растения и животные (эмульсин розоцветных, миндальные орехи, люцерна, кофе, пшеничные отруби, слизистая собак, овец, коз, крыс, баранов и быков). Однако применение лактазы растительного и животного происхождения затруднено вследствие ее незначительного содержания в данных источниках, сложности извлечения и невозможности сознательного накопления в растительных и животных организмах.

Целесообразно использовать лактазу, продуцируемую микроорганизмами: из дрожжей Saccharomyces lactis, Saccharomyces fragilis, Torulopsis versatilis, Torulopsis sphaerica, Candida pseudotropicalis, и др.; из грибов Aspergillus niger, Aspergillus orizae, Aspergillus flavus и др.; из бактерий Escherihia сoli, молочнокислых и др.

Смесь моносахаров при полном гидролизе лактозы в деминерализованном пермеате при температуре 25^оС имеет 88 % растворимости и 70 % сладости сахарозы. Рациональным является степень гидролиза не более 70-80 %, что обусловлено более высокими затратами большей степени гидролиза. При 80 %-ом гидролизе происходит увеличение сладости в 4,66 раза и растворимости в 2,73 раза по сравнению с негидролизованной лактозой.

Существует два основных метода гидролиза лактозы: кислотный и ферментативный. Для получения оптимальных результатов необходимо соблюдать следующие условия: гидролизуемое сырье должно иметь хорошее санитарно-гигиеническое состояние, что позволяет обрабатывать его как в свежем, так и пастеризованном виде; величина рН во время процесса должна быть постоянной и зависеть от свойств используемого фермента в случае его применения; с целью более полного гидролиза необходимо регулировать гидродинамические параметры процесса.

Кислотный метод, используемый для гидролиза лактозы, прост и не требует использования дорогостоящего ферментного препарата. Он характеризуется жесткими условиями: низкими значениями рН (1-2) и высокими температурами (80-150°С). Кислотный гидролиз проводят либо в растворе, содержащем свободную кислоту, либо с использованием кислой катионообменной смолы. Перед проведением гидролиза из сыворотки удаляют белки и проводят деминерализацию. Этот тип гидролиза характеризуется возникновением побочных продуктов, придающих раствору кремовую окраску. Продукты, выработанные с применением этого процесса, являются кислыми и перед использованием необходима их нейтрализация.

На основании исследований гидролитического действия b-галактозидазы из Klyveromyces fragilis И.С. Хамагаевой и М.Б. Даниловым установлены рациональные параметры использования фермента: рН от 6,7 до 6,9; температура 37^оС, концентрация фермента 2 Е/мл в течение 1,5-2,0 часов. Показано, что реакции гидролиза и трансгликозилирования взаимосвязаны, с повышением гидролитической активности b-галактозидазы в молоке усиливается ее трансгликозилирующее действие. При этом отмечена активизация роста бифидобактерий в субстратах, что связано с появлением кроме глюкозы и галактозы, олигосахаров (главным образом, аллолактозы, индуцирующей биосинтез собственной b-галактозидазы у бифидобактерий).

Известны биохимические свойства препарата «Максилакт», полученного в Нидерландах фирмой Gist-Brocades из дрожжей K. lactis. Изучали влияние на процесс гидролиза температуры, рН среды, концентрации фермента и массовой доли лактозы (табл. 3.12). Анализ полученных данных позволил получить рациональные параметры гидролиза.

Таблица 3.12

Степень гидролиза лактозы препаратом «Максилакт»

Во ВНИИМС под руководством Ю.Я. Свириденко исследованы свойства фермента, полученного НПО «Биотехнология» из культуры гриба Penicillium canescens. Фермент лактоканесцин (активность 1000 ед/г) является кислой b-галактозидазой, гидролизующей лактозу молочной сыворотки в диапазоне рН от 2,5 до 6,5 с максимумом активности при рН 4,0-5,0. Температурный оптимум активности фермента 50^оС, при температуре гидролиза вышеуказанной начинает инактивироваться. Известны протеолитические свойства этого препарата в отношении сывороточных белков.

Биохимические свойства лактоканесцина во многом определяются глубиной гидролиза лактозы: в сыворотке с массовой долей сухих веществ 20 % глубина гидролиза не изменяется при соотношении «фермент - субстрат» и резко снижается при более высокой концентрации сухих веществ.

В этой же работе показаны закономерности формирования сиропов с гидролизованной лактозой из сыворотки, подвергнутой электродиализу. Автор успешно совмещал ферментативный гидролиз и деминерализацию, целью которой являлось сокращение продолжительности процесса и снижение потерь сырья. Совмещение технологических операций привело к сокращению периода полураспада лактозы в два раза (с 7,1 часа до 3,7 часа). При общей продолжительности совмещенного технологического процесса 5 часов обеспечивается глубина гидролиза лактозы более 50 % и степень деминерализации сыворотки не ниже 90%.

Установленные закономерности являются теоретической основой технологии производства сыворотки сгущенной деминерализованной и сыворотки сгущенной деминерализованной гидролизованной, которая используется для приготовления сиропов с гидролизованной лактозой.

Возможным направлением биотехнологической переработки молочной сыворотки является ее использование в производстве алкогольных напитков путем сбраживания лактозы до этилового спирта с помощью специальных заквасок, поскольку лактоза не сбраживается пивными дрожжами. В связи с этим изучена возможность сбраживания продуктов ферментативного гидролиза лактозы иммобилизованными в криогель поливинилового спирта дрожжами Saccharomyces cerevisiae непрерывным способом (табл. 3.13). В качестве субстрата использовали творожную сыворотку с содержанием сухих веществ 20 %, степенью гидролиза 50 % и содержанием глюкозы 6 %.

Таблица 3.13