Ферменты как катализаторы. Кинетика биохимических реакций. Уравнение Михаэлиса – Ментен.

В процессе жизнедеятельности в любом живом организме совер­шаются сложнейшие и многообразные превращения химических веществ различной природы. Подавляющее большинство, а по не­которым данным даже все химические реакции в живых организ­мах протекают с участием биологических катализаторов — фер­ментов. Этим и объясняется легкость прохождения этих реакций.

Ферментативный катализ существенно отличается от химиче­ского катализа. Эти отличия сводятся к следующему.

Каталитическая активность. По активности биологические ката­лизаторы в миллионы раз превосходят активность химических ка­тализаторов. Даже лучший из неорганических катализаторов — атомная платина — уступает, например, ферменту каталазе по ак­тивности в расчете на 1 активный центр в тысячи раз. О скорости ферментативных реакций можно судить по следующему примеру: 1 моль фермента сахарозы способен расщепить в 1 с 1000 моль свекловичного сахара.

Ничтожно малые количества ферментов способны расщеплять огромные количества реагирующих веществ. Так, 1 г кристалличе­ского пепсина расщепляет 50 кг коагулированного яичного белка, а 1 г кристаллического ренина свертывает 72 т молока. Фермент пероксидаза, который ускоряет окисление субстрата за счет пероксида водорода, проявляет свою активность при разбавлении 1 мас. ч. фермента в 500 000 000 мас. ч. воды.

Согласно рекомендации международной комиссии по номенкла­туре ферментов каталитическая активность фермента может быть охарактеризована его «молекулярной активностью», под которой следует понимать число молекул данного субстрата или эквивален­тов затронутых групп, превращаемых за 1 мин одной молекулой фермента при оптимальной концентрации субстрата.

Высокая химическая специфичность. В отличие от химических катализаторов ферменты обладают значительно большей специ­фичностью: каждый из них действует лишь на строго определен­ную реакцию или группу реакций, протекающих в организме. Предполагается, что в организме человека одновременно функцио­нирует около 1000 различных ферментов. При этом они образуют сложные ферментативные системы, которые обеспечивают в живой клетке протекание целого ряда строго последовательных и согла­сованных между собой реакций. Если бы ферменты не обладали столь высокой специфичностью, это привело бы к быстрому распа­ду всех веществ в клетках и к гибели всего организма.

Специфичность ферментов подразделяется на абсолютную (или химическую) и стереохимическую.

Абсолютная специфичность — это действие каждого фермента на вещество строго определенного химического состава. Например, фермент уреаза катализирует только гидролиз мочевины, фермент пепсин — только расцепление белков, каталаза действует лишь на пероксид водорода.

Стереохимическая специфичность заключается в том, что фер­менты действуют только на определенные стереоизомеры органиче­ских соединений. В качестве примера подобной специфичности мож­но указать на действие двух ферментов: α- и β-глюкозидазы. Фер­мент α-глюкозидаза действует только на α-глюкозиды, а β-глюкозидаза — на β-глюкозиды, что хорошо видно на приведенной схеме:

Причины столь высокой специфичности ферментов еще до конца не изучены. Существует целый ряд теорий, объясняющих механизм действия ферментов.

Так, немецкий химик Фишер для объяснения специфичности фермента по отношению к данному субстрату в свое время пред­ложил гипотезу «замка и ключа». Согласно этой гипотезе молекула субстрата точно соответствует по своей форме некоторому участку на молекуле фермента. Фишер полагал, что «ключ» — субстрат точ­но подходит к ферменту — «замку» без какого бы то ни было нару­шения формы обеих молекул. Однако, как показали исследования, в ряде случаев гипотеза Фишера не может объяснить некоторые факты.

Для того чтобы привести эту теорию в соответствие с опытными данными, Кошланд несколько видоизменил модель «ключ — замок». Согласно его гипотезе субстрат, присоединяясь к активному центру, изменяет его форму, обеспечивая таким образом идеальное их соот­ветствие. Иными словами, функциональные группы в активном центре принимают специфическую пространственную конфигурацию только тогда, когда их вынуждает к этому присутствие суб­страта.

Так, образование фермент-субстратного комплекса может про­исходить за счет электрически заряженных группировок как на ферменте, так и на субстрате. Такими группировками могут быть

В результате подобного взаимодействия в субстрате могут происхо­дить определенные химические изменения, выражающиеся в обра­зовании новых функциональных групп с совершенно иными поляр­ными свойствами. После реакции фермент и субстрат как бы оттал­киваются друг от друга, и фермент вновь готов вступить во взаимо­действие с другой молекулой субстрата. Химически измененный субстрат отщепляет продукт реакции.

Таким образом, специфичность фермента обусловливается его конфигурацией, строением и электрическими свойствами активной группы фермента.

Инактивация.Впроцессе протекания каталитической реакции фермент постепенно разрушается и утрачивает свою активность. Это явление получило название инактивации. Опыт показывает: чем большей активностью обладает фермент, тем он сильнее раз­рушается в процессе катализа. Этим свойством ферменты сущест­венно отличаются от неорганических катализаторов, которые, как уже отмечалось, остаются без изменения в продуктах реакции.

Строение ферментов.По сравнению с неорганическими катализа­торами ферменты имеют значительно более сложное строение. Каждый фермент содержит белок, которым и обусловлена высокая специфичность биологических катализаторов. По своему строению ферменты подразделяются на два больших класса: однокомпонентные и двухкомпонентные. К однокомпонентным относятся фермен­ты, состоящие только из белковых тел, которые обладают катали­тическими свойствами. У этих ферментов роль активных групп вы­полняют определенные химические группировки, входящие в состав белковой молекулы и получившие название активных центров.

В настоящее время свыше 100 известных однокомпонентных фер­ментов по

лучено вкристаллическом виде.

К двухкомпонентным относятся такие ферменты, которые состо­ят из белковой и небелковой части, называемой простетической группой. Было предложено активную простетическую группу назы­вать агон, а белковый носитель — ферон или иначе апофермент. Исследования показали, что белковая часть двухкомпонентного фермента (ферон) оказывает решающее влияние на специфичность его действия. Вместе с тем соединение активной группы с белком приводит к огромному возрастанию ее каталитической активности.

Было также показано, что прочность связи агона и ферона у раз­ных ферментов различна. У некоторых ферментов, например дегидрогеназ, катализирующих окисление различных субстратов пу­тем отнятия водорода (дегидрирование), эта связь является непроч­ной. Такие ферменты легко диссоциируют и распадаются на агон и ферон. По предложению выдающегося французского биохимика Г. Бертрана, агоны, легко отделяющиеся от белковой части фермен­та, обычно называют, коферментами.

В качестве примера двухкомпонентного фермента можно назвать фермент пируватдекарбоксилаза, который расщепляет пировиноградную кислоту на уксусный альдегид и оксид углерода (IV):

Химическая природа активной группы пируватдекарбоксилазы в настоящее время полностью выяснена. Она представляет собой соединение молекулы витамина B₁ и двух остатков фосфорной кис­лоты. Пируватдекарбоксилаза является примером фермента, ак­тивная группа которого содержит витамин. Как показали исследо­вания, витамины являются неотъемлемой составной частью целого ряда важнейших ферментов (каталаза, пероксидаза и др.).

Влияние внешних условий. По своей природе ферменты значи­тельно более чувствительны к изменению внешних условий, чем неорганические катализаторы. В частности, ферменты «работают» в значительно более узком диапазоне температур. Температурный оптимум большинства растительных ферментов 313—333 К, живот­ных ферментов 313—323 К. Если температура превысит эти преде­лы, активность фермента очень быстро падает, а при 343—353 К происходит их необратимое разрушение, обусловленное денатура­цией белка. Лишь очень немногие ферменты способны в определен­ных условиях выдержать нагревание до 373 К без потери актив­ности.

Неорганические катализаторы, как показывает опыт, могут от­лично работать и при более высоких температурах — до несколь­ких сот градусов.

В отличие от неорганических катализаторов ферменты проявля­ют свою активность в строго определенном диапазоне значений рН среды. В табл. 2.1 приведены значения рН, при которых раз­личные ферменты проявляют свою максимальную активность.

Как видно из этой таблицы, диапазон значений рН весьма ши­рок для активности различных ферментов. Влияние рН на активность ферментов объясняется изменением состояния ионизации не только фермента и субстрата в отдельности, но и фермент – субстратного комплекса.

Различные ферменты имеют различный оптимум pH.

Ферменты разных с/х культур имеют разные оптимальные значения pH:

У риса 4,5 < pH _optim < 5,5

У пшеницы 6,0 < pH _optim < 7,0

В общем виде: V_кат. = f (T,pH)

Кинетика биохимических реакций описывается уравнением Михаэлиса – Ментен. Михаэлис и Ментен изучали скорость реакции гидролиза АТФ миозином. Белки актин, миозин и АТФ играют определяющую роль в процессе мышечных сокращений.

АТФ ^{гидролиз}→ АДФ + Ф + Е

Е – эта энергия используется при мышечных сокращениях.

АТФ – субстрат (реагент);

Миозин – катализатор.

υ₀ = υ_{0 max} ∙ S₀ / K_S + S_{0 2.31а}

где υ₀ – начальная скорость реакции;

υ_{0 max} – теоретически определенная начальная скорость реакции при max концентрации субстрата;

S₀ – начальная концентрация субстрата;

K_S – такая концентрация субстрата, при которой: υ₀ = ½ υ_{0 max}

1) при малых S₀ зависимость υ₀ = f (S₀) линейна (подчиняется уравнению реакции Ι – го порядка);

2) при S₀ » K_S реакция нулевого порядка относительно концентрации субстрата, т. е. начальная скорость не зависит от концентрации субстрата, наступает насыщение.