БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ 23 страница

P-T-G-C-A-C-T-T-G-A-A-C-G-C-A-T-G-C-T

Расщепление ДН К по остаткам (а)-,'

P-T-G-C-A-C-T-T-G-A-A-C-G-C

Р—Т—G—С—А—С—Т—T—G—А + C-G-C-A-T-G-C-T

A-C-G-C-A-T-G-C-T

C-T -T-G -А-А-С —G —С —А —T —G —С —T

Немеченые фрагменты

Электрофореграмма

Рис. 5.2. Схема получения семейства меченных по 5'-концу фрагмен ДНК в результате расщепления по определенному нуклеотиду (А)

В биотехнологии рекомбинантных ДНК обычно используют два различных метода секвенирования ДНК: химический и фермен­тативный. Оба метода чрезвычайно надежны, быстры в исполне­нии И результативны. Результаты секвенирования позволяют так­же на основе генетического кода определить аминокислотную пос­ледовательность белка в соответствии с нуклеотидной последо­вательностью в соответствующем гене. На рис. 5.2 представлена схема химического метода секвенирования ДНК Исходный фраг­мент ДНК, меченный ³²Р по 5'-концу, подвергается специфи­ческому расщеплению по определенному нуклеотиду (например, А), в результате чего образуются радиоактивные фрагменты раз­ной длины, которые разделяются по размерам при гель-электро­форезе, а радиоактивные из них выявляются с помощью радиоавто­графии.

Обычно химическая процедура расщепления ДНК выполняет­ся одновременно для четырех одинаковых проб ДНК с использо­ванием химических агентов, расщепляющих ДНК по отдельным нуклеотидам (Т, С, G и А). Полученные образцы подвергают элек­трофорезу на параллельных дорожках одного геля, и по его ре­зультатам можно определить нуклеотидную последовательность ДНК (рис. 5.3).

Энзиматический метод секвенирования основан на энзиматичес- ком введении нуклеотида, терминирующего полинуклеотидную цепь (рис. 5.4). В этом случае обычно используют дидезоксирибо- нуклеозидтрифосфаты, в которых дезоксирибоза-З'-ОН, представ­ленная в нормальных нуклеотидах, отсутствует. Такой модифици­рованный нуклеотид, внедряясь в цепь ДНК с помощью ДНК- полимеразы, блокирует присоединение следующего нуклеотида. Синтез in vitro молекулы ДНК в присутствии затравки (прайме- ра) и небольшого количества одного из таких модифицирован­ных нуклеотидов приводит к образованию фрагментов ДНК в виде «лесенки». Если для получения таких фрагментов применять мече­ную ДНК (обычно проводят четыре реакции синтеза с использо­ванием различных нуклеотидов, терминирующих цепь), а электро- форетический анализ проводить на четырех дорожках геля, то мож­но определить последовательность нуклеотидов. В настоящее вре­мя используют модифицированный метод, сводящийся к флуо­ресцентному анализу наборов фрагментов ДНК в процессе дви­жения по одной дорожке геля.

Важнейший метод получения рекомбинантных ДНК основан на способности нуклеиновых кислот быстро восстанавливать свою структуру после нагревания до 100 "С в сильно щелочной среде (рН 13). При нагревании до 100 °С комплементарные пары основа­ний разрушаются и ДНК диссоциирует на две раздельные цепи. Этот процесс назван денатурацией ДНК («плавлением»). Выдер­живание комплементарных цепей при температуре 65 °С приводит

Последовательность нуклеотидов во фрагменте ДНК Рис. 5.3. Схема электрофореграммы, полученной с помощью химическо­го метода секвенирования ДНК (первая снизу строка соответствует нук- леотиду на 5'-конце и является нуклеотидом Т на уровне первой дорожки. Для определения полной последовательности (отмечено пунктиром) про­водят анализ послойно всех дорожек

к их спариванию и восстановлению структуры двойной спирали (гибридизация, ренатурация, или «отжиг»). Это свойство ДНК широко используют в химической систематике, а также для ре­шения эволюционных и филогенетических проблем.

Скорость восстановления (ренатурации) двойной спирали за­висит от вероятности столкновения двух комплементарных нук- леотидных последовательностей и их концентрации в растворе. Ско­рость реакции гибридизации можно использовать для определе­ния концентрации любых последовательностей РНК или ДНК в смеси, содержащей и другие фрагменты нуклеиновых кислот. Для этого необходимо иметь чистый одноцепочечный фрагмент ДНК, комплементарный к тому фрагменту, который надлежит выявить. Обычно фрагмент ДНК, полученный клонированием либо хими­ческим путем, метят по ³²Р в целях прослеживания включения фрагмента в состав дуплексов при гибридизации. Одноцепочеч-

А

Флуоресцентно-меченная затравка для ДНК-полимеразы

Смесь дНТФ с добавлением небольшого количества дидНТФ

5'У///////Л GCTACCTGCATGGA

з'ШЯгггШгЕс CGATGGACGTACCTCTGAAGCG^

Одноцепочечная ДНК, нуклеотидную последовательность которой надо определить

Включение дидНТФ блокирует дальнейший рост молекулы ДНК

gctacctgcatgga Y/МШЛ GCTA

УМ////М ГгГТАГГТГ.ГА

Смесь флуоресцирующих молекул комплементарной ДНК различной длины, оканчивающихся на А

СИЗ

Рис. 5.4. Схема энзиматического метода секвенирования нуклеиновых кис­лот, основанного на энзиматическом введении нуклеотида, терминирую­щего цепь:

щщш

?

Смесь молекул Смесь молекул, Смесь молекул, Смесь молекул,

различной длины, оканчива- оканчива- оканчива-

оканчиваюшихся на А ющихся на Т ющихся на С ющихся на G

в очень низкой концентрации и тем самым определять, какое ко­личество копий последовательности ДНК, комплементарной ДНК- зонду, присутствует в геноме клетки.

ДНК-зонды применяют для поиска родственных генов; в реакциях гибридизации с РНК — для выявления экспрессии дан­ного гена в различных клетках. Для выявления молекул нуклеино­вых кислот, комплементарных всему зонду (или его участку), ДНК- зонды часто сочетают с методом гель-электрофореза, что позво­ляет получать информацию о размерах гибридизируемых молекул ДНК. Эффективное использование современных приборов, спо­собных автоматически синтезировать любые нуклеотидные пос­ледовательности за короткий промежуток времени, дало возмож­ность перестраивать гены, что представляет собой один из важ­ных аспектов генной инженерии. Обмен генами, а также введение в клетку гена другого вида организма осуществляют посредством генетической рекомбинации in vitro. Этот подход был разработан на бактериях, в частности на Е. coli. Он основан на важном свойстве ДНК — способности к перестройкам, изменяющим комбинацию генов в геноме и их экспрессию. Такая уникальная способность ДНК позволяет приспосабливаться данному виду к изменяющей­ся среде. Генетическую рекомбинацию подразделяют на два боль­ших класса: общую рекомбинацию и сайт-специфическую реком­бинацию. В процессе общей рекомбинации генетический обмен в ДНК происходит между гомологичными нуклеотидными после­довательностями, например между двумя копиями одной и той же хромосомы в процессе мейоза (кроссинговера), или при скре­щивании и перегруппировке генов у бактерий.

В процессе сайт-специфической рекомбинации в обмен вступа­ют короткие специфические нуклеотидные последовательности одной и той же или обеих спиралей ДНК, распознаваемые осо­бым сайт-специфическим ферментом, что приводит к трансфор­мации распределения нуклеотидных последовательностей в гено­ме. Любые комплементарные взаимодействия между двумя гомо­логичными спиралями ДНК возможны лишь тогда, когда в одной из двух цепей происходит разрыв. К числу факторов, вызывающих такие одноцепочечные разрывы, относят: химические агенты, не­которые виды излучения, специфические белки. Например, у Е. coli обнаружен белок rec BCD, который вызывает в молекулах ДНК одноцепочечные разрывы. Белок rec BCD представляет собой ДНК- зависимую АТРазу, которая действует как ДНК-хеликаза, пере­мещающаяся по спирали ДНК и вызывающая ее расплетение. Под влиянием этого белка, обладающего нуклеазной и хеликазной ак­тивностью, на двойной спирали ДНК возникает разрыв с образо­ванием одноцепочечного участка «ус» (whisker) (рис. 5.5).

Белок rec BCD присоединяется к двойной спирали ДНК с од­ного конца (5') и со скоростью около 300 нуклеотидов в секунду
движется вдоль спирали ДНК за счет гидролиза АТР. Одновремен­но с белком движется и возникшая петля ДНК. Когда петля на спирали достигает участка, называемого сайтом узнавания (recogni­tion site), одна из цепей разрывается с освобождением небольшо­го одноцепочечного участка «ус». Возникший «ус» инициирует даль­нейшую генетическую рекомбинацию.

Белок rec BCD Рис. 5.5. Схема процесса общей рекомбинации с участием белка rec BCD у E.coli: А — двойная спираль ДНК; Б — присоединение к двойной спирали белка rec BCD с последующим его перемещением; В — возникновение разрыва в сайте узнавания; Г — образование одноцепочечного участка «ус»

В процессе общей генетической рекомбинации центральная роль отводится комплементарным взаимодействиям нуклеотид- ных последовательностей. Кроме того, этот процесс требует уча­стия особого белка гесА с Mr, равной 38 кДа. Белок гесА прочно связывается в виде крупных кластеров с одиночными цепями ДНК, одновременно удерживая и двойную спираль. За счет двух сайтов данный белок имеет еще один участок — для связывания и гидролиза АТР, т.е. он представляет собой ДНК-зависимую АТРазу. Благодаря особенностям белка гесА осуществляются од-

Рис. 5.6. Схема начального одноцепочечного обмена между двумя гомо­логичными двойными спиралями ДНК в процессе общей рекомбинацго¹

ноцепочечный обмен между двумя двойными спиралями (рис. 5. с удалением некоторого количества нуклеотидов и локальный ре синтез ДНК.

Разрыв в одной из цепей ДНК высвобождает эту цепь, и он внедряется во вторую спираль, образуя короткий спаренный учас

ток. После начального обмена tomi логичные нуклеотидные последовг тельности двух взаимодействующв спиралей устанавливаются в строго соответствии одна с другой, в связс с чем происходит расширение обл? сти спаривания и быстрый обме между спиралями. Для этого процеа, разные организмы используют нес динаковые механизмы, большинств из которых включает в качестве прс межуточного этапа обмен с перекр. щиванием цепей между двумя сш ралями ДНК (рис. 5.7).

Структура, образующаяся при оР мене с перекрещиванием цепей, сС держит две перекрещенные и две н перекрещенные цепи. Она способ? : существовать в различных изомернР

формах. Изомеризация меняет пол| жение двух пар цепей: две ранее п! рекрещивающиеся цепи становяТ( неперекрещивающимися и наобор<1 Для того чтобы восстановили^ две отдельные спирали ДНК и flj самым прекратился процесс спар вания, в каждой из двух перекрещён ных цепей должен произойти разр! (рис. 5.8).

--- AT Г Ц AATT ЦАГТЦ

ТАЦГ ТТААГТЦАГ

Сшивание | ДНК-лигаза

АТГЦ-ААТТ-ЦАГТЦ ТАЦГ-ТТАА-ГТЦАГ

-АТГЦААТТ ЦТГАГАТЦЦА ТАЦГ

ТАЦГ ТТААГАЦТЦТ АГГТАТГЦ

Фрагмент 1 Линкер Фрагмент 2

----- AT ГЦ Г Г Г Ц Ц Ц ГТ А Ц-------------

--- ТАЦГЦЦЦ Г Г ГЦА T Г-----

Мет Тир Гли Гли Фен Лей Stop , I 11 I I и и м 11 I ,.

.ААТТ^ЦАТГТАТГГТГГЦТТТЦТГТАА

ГТАЦАТАЦЦАЦЦГАААГАЦАТТЦТАГ'^

■ EcoRI \BamHI

«Липкий» \

конец «Липкий»

конец

Один из важных этапов конструирования молекулы ДНК дотирование (или сшивание) генов с помощью фермента ДНК лигазы. Сшивание фрагментов ДНК, содержащих нужные гень осуществляют двумя основными методами: а) по «липким» кой* нам; б) с помощью искусственно достроенных «липких» концов Сшивание генов (фрагментов) ДНК по «липким» концам, т.1 взаимнокомплементарным участкам, длиной из 4—6 пар нукле< тидов, достаточно легко осуществляется ферментом ДНК-лиг^ зой с образованием ковалентной фосфодиэфирной связи меж!| соседними нуклеотидами:

--АТГЦААТТ ЦАГТЦ----------- V

ТАЦГ ТТААГТЦАГ----------- *

Сшивание | ДНК-лигаза AT Г Ц ААТТ-ЦАГТЦ

ТАЦГ-ТТАА-ГТЦАГ •

if Ее

Чаще других в генетической инженерии в качестве векторов исполь­зуют плазмиды. Плазмидами называют бактериальные репликоны (внехромосомные элементы наследственности), стабильно насле­дуемые. Они представляют собой двуцепочечные кольцевые моле­кулы ДНК с вариабельными молекулярными массами. По разме­ру они соответствуют 1 — 3 % генома бактериальной клетки. Так, молекулярная масса одной из самых мелких плазмид, найденных у Е. coli, составляет 1,5 МДа, а клетки псевдомонад содержат плаз­миды с Mr около 300 МДа, что составляет 15 % от Mr хромосом этих бактерий. Плазмиды разделяют на конъюгативные, способ­ные сами перенестись в реципиентные клетки с помощью конъю­гации, и не конъюгативные, не обладающие этим свойством. Они детерминируют разные свойства: резистентность к антибиотикам (R-плазмиды); биодеградацию (D-плазмиды) и др. Например, плаз­миды стафилококков несут гены устойчивости к пенициллину, соединениям ртути и др. Гены устойчивости к тяжелым металлам обнаружены также в составе R-плазмид Е. coli. Плазмиды могут управлять синтезом инсектицида в клетках Bacillus thuringiensis. F- плазмида Е. coli или FP-плазмиды псевдомонад являются поло­выми факторами. Плазмида pS 101 с Mr 5,8 МДа несет ген устой­чивости к тетрациклину (селективный маркер). У различных мик­роорганизмов — Е. coli, Salmonella, Bacillus, Saccharomyces обнаружены Col-плазмиды, обеспечивающие синтез разных ко- лицинов — высокоспецифических антибиотиков, подавляющих жизнедеятельность других штаммов микроорганизмов того же вида или родственных видов. Количество плазмид в клетке может коле­баться от одной до более ста. В целом чем крупнее плазмида, тем меньше количество ее копий в клетке.

Первый плазмидный вектор был получен С.Коэном (1973). Его источником была плазмида Е. coli R₆_₅ с Mr 65 кДа. Плазмида стала родоначальником серии векторов и других структур. Особое место в генетическом манипулировании занимает плазмида, от­носящаяся к группе колициногенных плазмид Е. coli. Col El реп­лицируется независимо от хромосомы и присутствует в количе­стве примерно 24 копий на клетку. Ее широко используют благо­даря селективному маркеру в качестве вектора для клонирования фрагментов про- и эукариотической ДНК в Е. coli.

Плазмида ColEl (Mr 4,2 МДа) применяется для клонирова­ния EcoRl-фрагментов. При этом интеграция чужеродного фраг­мента в участок узнавания EcoRI ведет к фенотипическому изме­нению клетки, прекращению синтеза колицина с сохранением иммунности к нему. Этот признак используют при отборе реком­бинантных трансформантов.

Плазмида pBR313 содержит уникальные участки расщеплений нескольких рестриктаз: EcoRI, Hindlll, BamHI, Sail, Xmal и Hpal. Конструируя рекомбинантную ДНК, в эти участки можно встра­
ивать фрагменты чужеродной ДНК, полученные с помощью со­ответствующих рестриктаз. На рис. 5.10 изображена схема распо­ложения генов в плазмиде pBR322. Плазмида pBR322 содержит два гена, программирующих устойчивость к двум различным ан­тибиотикам — тетрациклину (ген tet) и ампициллину (ген Ыа). В гене tet находятся уникальные участки расщепления рестриктаза- ми Hindlll, BamHI и Sail, а в гене Ыа — участок расщепления Pstl. Если разрезать плазмиду любой из рестриктаз, участок расщепле­ния которой находится в гене tet, и соединить ее методом «лип­ких» концов с чужеродным фрагментом ДНК, то в полученной рекомбинантной молекуле останется нетронутым только ген Ыа, а ген tet утрачивает свою активность, так как его целостность на­рушается вставкой. Напротив, при разрезании плазмиды рестрик- тазой Pstl и внедрении в этот участок фрагмента ДНК инактиви- руется ген Ыа, тогда как ген tet продолжает кодировать белок, обеспечивающий устойчивость Е. coli к тетрациклину. Плазмид- ные векторы в настоящее время чрезвычайно разнообразны за счет следующих свойств:

уменьшения размеров плазмиды вследствие изъятия участков, не обязательных для репликации (чем больше плазмида содержит уникальных участков узнавания для рестриктаз, тем она универ­сальнее);

EcoRI XmnI 4361 Clal 23 ACGI 2246 2246 Snal 2246 Рис. 5.10. Схема строения плазмиды pBR322

гибридизации векторов одного рода с другими векторами или природными плазмидами (например, получены гибридные векто­
ры комбинацией плазмиды и фага X (при этом вновь сконструиро­ванная рекомбинантная ДНК должна сохранить репликационные свойства исходной плазмиды);

использования новых плазмид;

применения транспозонов;

создания векторов с генетическими маркерами, позволяющи­ми вести отбор рекомбинантных клонов.

Эукариотические вирусы до сих пор нашли более скромное при­менение в качестве векторов. Практически используются только онкогенный вирус SV 40 и его производные. Все эти векторы — дефектные вирусы, не способные давать полноценные вирусные частицы в клетке хозяина. Анализируемую ДНК можно вводить и в другие репликоны, способные размножаться в клетках, напри­мер бактериофаги. Чаще всего из известных фагов в качестве век­торов применяют сконструированные производные фага X и фа­гов М13 и fd. В векторах на основе бактериофага X используется его особенность, состоящая в том, что большая часть его ДНК не участвует в размножении фага в клетке. Это позволяет вводить чужеродную ДНК в ДНК фага X в качестве вектора.

Фаг М13 — это одноцепочечная циклическая ДНК длиной около 6500 нуклеотидов. После инфицирования бактериальной клетки одноцепочечная ДНК фага превращается в двуцепочечную реп- ликативную форму (RF), которая подобна плазмиде. Фаговая ДНК содержит, кроме того, короткий участок из 500 нуклеотидов, на­званный как МП (межгенная последовательность), не существен­ный для ее жизнедеятельности. Именно в этот участок МП репли- кативной формы ДНК после расщепления ее с помощью лигазы вставляют чужеродную ДНК. Введение рекомбинантной двуцепо- чечной молекулы в клетку Е. coli приводит к ее репликации, син­тезу (+) цепи, упаковке последней в белковый чехол и выделе­нию фага в среду. Инфицированная нитевидным фагом клетка про­должает делиться, выделяя в окружающую среду большое коли­чество фага. Этот фаг содержит в вирионе одноцепочечную цик­лическую ДНК, в которую встроена одна из цепей чужеродной ДНК.

Векторные плазмиды и векторные вирусы со встроенными чу-⁴ жеродными генами часто называют гибридными (или химернымиi); плазмидами (или фагами). После конструирования рекомбинант-f ных ДНК их с помощью трансформации вводят в реципиентный организм: бактериальную, грибную, растительную или животнук? клетку. Трансформация предусматривает предварительную o6paf ботку клеток соединениями, обусловливающими проникновени| ДНК внутрь клеток с последующим их помещением в среду, I которой способны существовать только клетки, получившие вещ торную молекулу, например в среду с определенным антибий тиком. 1

120

Процесс инфицирования клеток с помощью чужеродных ДНК, приводящий к образованию зрелого фагового потомства, назван трансфекцией.

Практически общий способ трансформации и трансфекции основан на том, что при обработке клеток бактерий СаС1₂ их мем­брана становится проницаемой для ДНК. Однако эффективность проникновения экзогенной ДНК в клетку довольно низка. Поэто­му среди бактерий, подвергшихся трансформации, только неболь­шая часть оказывается трансформированной. Отделение ее от об­щей массы осуществляется в процессе клонирования. Для клони­рования бактериальную суспензию определенной концентрации выливают на твердую питательную среду, например на агар с питательными добавками в чашке Петри из расчета 5—10 бакте­рий на 1 см² поверхности. Бактериальная клетка на поверхности агара начинает делиться с образованием в итоге маленькой коло­нии, похожей на шляпку гриба. Эта колония называется клоном, причем из каждой клетки образуется свой клон, все клетки кото­рого имеют свойства бактерии-родоначальника.

Отбор бактерий-трансформантов можно продемонстрировать, используя плазмиду pBR322 (см. рис. 5.10), содержащую два гена устойчивости к тетрациклину и ампициллину. Для отбора этих бак­терий в агар добавляют антибиотик — или ампициллин, или тет­рациклин в зависимости от того, какой из генов (Ыа или tet) ос­тался интактным после введения чужеродной ДНК. На такой сре­де клоны образуют клетки только с плазмидами. Для отделения рекомбинантных бактерий часть материала каждого клона пере­носят на другую чашку Петри, содержащую антибиотик, ген ус­тойчивости к которому был разрушен при создании рекомбинан- тов. На этих чашках Петри дают клоны только те бактерии, кото­рые содержат исходную плазмиду, а рекомбинантные бактерии их не образуют. Такая тщательная селекция клонов по устойчиво­сти к антибиотику позволяет идентифицировать рекомбинантные клоны. При поиске рекомбинантных клонов успешно применяют метод авторадиографии.

Рекомбинантные клоны могут быть идентифицированы и по синтезируемому ими продукту. Но чаще приходится идентифици­ровать непосредственно нуклеотидную вставку с использованием методов гибридизации. С этой целью бактериальные колонии вы­ращивают на нитроцеллюлозных фильтрах, помещенных на чаш­ку Петри с питательной средой. Далее приготовляют реплики: к фильтру с исходными колониями прижимают свежий нитроцел- люлозный фильтр, который затем переносят на чашку Петри с плотной питательной средой, где образуются колонии, идентич- ^Hbie первым.

Затем фильтр-реплику подвергают щелочной обработке, при ^Эт0М клетки в колониях лизируют и денатурированная ДНК из клеток связывается с нитроцеллюлозой в том участке, где былс. расположена соответствующая колония. При радиоактивной ДНК или РНК (меченной ³²Р или ¹²⁵J) выдерживание фильтра в ра створе, содержащем радиоактивный полинуклеотид, приводит гибридизации с комплементарными последовательностями. В ито­ге те участки фильтра, в которых находились рекомбинантны клоны с требуемой вставкой, оказываются радиоактивными * идентифицируются радиоавтографически.

5.4. ЭКСПРЕССИЯ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ

Эффективность функционирования бактериальных генов не одинакова, что обусловливает вариабельность концентрации от­дельных белков в зависимости от их функций. Такие вариаций белков, например у Е. coli, обусловлены системой контроля ген ной экспрессии, осуществляемой в основном на уровне транс крипции ДНК, и зависят от количества синтезируемой на данно» гене мРНК и активности фермента РНК-полимеразы. Порядок чередовании нуклеотидных последовательностей в промоторно! участке структурного гена определяет степень активности РНК- полимеразы и инициацию процесса транскрипции. Бактериаль ные гены, включенные в геном, как правило, экспрессируютс? достаточно легко, давая мРНК и белок в силу того, что в сиг нальных последовательностях, управляющих процессами транс крипции и трансляции у различных прокариотических органиЗ мов, много общих черт. Что касается экспрессии генов эукариот бактериях, то она происходит крайне редко, если не создаваТ специальные условия, поскольку регуляторные участки эукариот отличны от таковых у бактерий. Регуляторные (сигнальные) участк не узнаются бактериальными РНК-полимеразами, что привода к замедлению транскрипции. При клонировании геномной ДН_Г<, эукариотической клетки экспрессия генов не происходит изч отсутствия у бактерий системы сплайсинга. Следовательно, д! экспрессии эукариотических генов в клетках прокариот необх| димо, чтобы данные гены находились под контролем прокари^ тических регуляторных элементов. В связи с этим для осуществл ния экспрессии эукариотического гена соответствующая кДЙ (или синтетическая ДНК), содержащая кодирующую последов тельность, в составе векторной молекулы (например, плазмида присоединяется к регуляторным элементам бактери и - промотор оператору и рибосом-связывающему участку.

Таким образом, в сконструированных промежуточных река бинантных ДНК эукариотический ген будет находиться под ко!§ ролем бактериальных регуляторных элементов. Целесообразй встраивать ген в подходящий вектор для экспрессии, который f содержит регуляторные элементы, способствующие активной экс­прессии встроенного гена после введения рекомбинантной плаз­миды в бактериальную клетку. Например, к таким эффективным регуляторным участкам принадлежит промотор гена р-лактамазы (ген устойчивости к ампициллину, входящий в состав плазмиды pBR322). Промотор гена Р-лактамазы нерегулируемый, а исполь­зование таких промоторов не всегда удобно, так как синтезиро­ванные белки в большом количестве могут блокировать рост бак­терий. В связи с этим целесообразнее использовать регулируемые сильные промоторы, включить которые для синтеза чужеродного белка можно и в том случае, когда получена большая бактериальная масса. В частности, к числу регулируемых сильных промоторов сле­дует отнести термочувствительный промотор pL, который ответ­ствен за экспрессию нескольких генов бактериофага. Белок-ре- прессор, блокирующий данный промотор, активен при 31 "С, но неактивен при 38 "С, следовательно, при инкубировании бакте­рий при 31 °С чужеродный ген не экспрессируется и, наоборот, повышение температуры вызывает инактивацию репрессора и вы­сокий уровень синтеза нужного белка.

Последовательность оснований длиной 6 — 8 нуклеотидов, рас­положенная непосредственно перед инициирующим кодоном АУТ у Е. coli, определяет эффективность процесса трансляции. Эта пос­ледовательность представляет собой участок связывания мРНК с рибосомой, и его сдвиг в ту или иную сторону способен умень­шать эффективность трансляции мРНК. По имени исследовате­лей, идентифицировавших этот участок, он был назван последо­вательностью Шайн-Дальгарно. Обычно эту последовательность включают в состав самого вектора вместе с инициирующим кодо­ном на нужном расстоянии. При экспрессии векторов такого типа образуется гибридный белок, в котором несколько N-концевых аминокислотных остатков происходят от источника регуляторных элементов и инициирующего кодона прокариотического гена. Та­кие гибридные белки часто более стабильны; обработка их хими­ческим или ферментативным способом приводит к выделению эукариотической части белка.