БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ 19 страница

Химико-ферментативные способы получения аминокислот

При получении ряда аминокислот химико-ферментативными способами используют энзимы, принадлежащие к разным клас­сам. Эти процессы могут быть как одностадийными (конверсии), так и многостадийными. Источником ферментов для большин­ства процессов служат энзимы микроорганизмов — как индиви­дуальные, так и их природные смеси, содержащиеся в интактных (не растущих), высушенных и лизированных клетках, клеточных экстрактах и, наконец, в препаратах иммобилизованных клеток и ферментов. Использование иммобилизованных ферментов в био­технологии будет рассмотрено в гл. 4.

Применение ферментов в производстве аминокислот обеспе­чивает стереоспецифичность процессов их синтеза, что выгодно отличает биотехнологические производства от химических. Далее будут рассмотрены примеры, иллюстрирующие эти положения.

Получение L-лизина. Процесс получения лизина основан на стереоспецифическом ферментативном гидролизе (конверсии) 0-,Ь-а-амино-е-капролактама, который сначала получают хими­ческим путем из циклогексена:

/^0Н

N CI N NHj ;. NH,

D-.L-a-амино-Е-капролактам

Рацемат используют в качестве субстрата, который под дей­ствием фермента L-a-амино-е-капролактамгидролазы (лактамаза) превращается в L-лизин, а оставшаяся непрореагировавшая его часть (D-форма) переводится при воздействии рацемазы в смесь антиподов:

о

Г nh₂

/ \ Лактамаза^ h₂N-(ch₂)₄-ch(nh₂)-cooh

^----- ' 1-лизин

Рацемическая смесь „ ⁺

гЯ НРМЯЧЯ

D- и L-a-амино-е- ----------------------- D-a-амино-е-капролактам

капролактама

Лактамаза найдена у некоторых видов дрожжей, в частности у Candida laurentii; у них синтез фермента индуцируется добавлени­ем субстрата (рацемической смеси), а активность энзима поддер­живается при добавлении в среду ионов Mg²⁺, Мп²⁺ и Zn²⁺. Раце-
рогёназы, лиазы, лигазы, изомеразы. Столь же разнообразен и перечень целевых аминокислот, производимых химико-фермен- тативным способом (L-аспарагиновая кислота, L-аланин, L-глу- тамиН, L-лизин, L-тирозин, L-триптофан, L-цистеин, L-фени- лаланин, L-метионин). Химико-энзиматический способ в сравне­нии с микробиологическим более специфичен, не требует проце­дуры очистки аминокислот от побочных продуктов и сточных по­токов. Однако по стоимости сырья и ферментативных препаратов он еще уступает микробиологическому способу.

3.4.2. Производство витаминов

Витамины представляют собой группу незаменимых органи­ческих соединений различной химической природы, необходи­мых любому организму в ничтожных концентрациях и выполняю­щих в нем каталитические и регуляторные функции. Недостаток того или иного витамина нарушает обмен веществ и нормальные процессы жизнедеятельности организма, приводя к развитию па­тологических состояний. Витамины не образуются у гетеротрофов. Способностью к синтезу витаминов обладают лишь автотрофы, в частности растения. Многие микроорганизмы также образуют це­лый ряд витаминов, поэтому синтез витаминов с помощью мик­роорганизмов стал основой для разработки технологий промыш­ленного производства этих биологически активных соединений.

Благодаря изучению физиологии и генетики микроорганизмов — продуцентов витаминов и выяснению путей биосинтеза каждого из них создана теоретическая основа для получения микробиологи­ческим способом практически всех известных в настоящее время витаминов. Однако с помощью энзимов целесообразнее произво­дить лишь особо сложные по строению витамины: В₂, В₁₂, Р-ка- ротин (провитамин А) и предшественники витамина D. Осталь­ные витамины либо выделяют из природных источников, либо синтезируют химическим путем. Витамины используются в каче­стве лечебных препаратов, для создания сбалансированных пи­щевых и кормовых рационов и для интенсификации биотехноло­гических процессов.

Получение витамина В₂ (рибофлавин). Вплоть до 30-х годов прошлого столетия рибофлавин выделяли из природного сырья. В наибольшей концентрации он присутствует в моркови и печени трески. Из 1 т моркови можно изолировать лишь 1 г рибофлавина, а из 1 т печени — 6 г. В 1935 г. обнаружен активный продуцент рибофлавина — гриб Eremothecium ashbyii, способный при выра­щивании на 1 т питательной смеси синтезировать 25 кг витамина В₂. Сверхсинтеза рибофлавина добиваются действием на дикие штаммы мутагенов, нарушающих механизм ретроингибирования синтеза витамина В₂, флавиновыми нуклеотидами, а также изме­нением состава культуральной среды. Отбор мутантов ведут по устойчивости к аналогу витамина В₂ — розеофлавину. Вопросы биосинтеза рибофлавина и его регуляции детально изучены в ра­ботах Г. М. Шавловского.

В состав среды для роста продуцентов витамина В₂ входят до­статочно сложные органические вещества — соевая мука, куку­рузный экстракт, сахароза, карбонат кальция, хлорид натрия, гидрофосфат калия, витамины, технический жир. Грибы весьма чувствительны к изменению состава среды и подвержены инфи­цированию. Перед подачей в ферментер среду подвергают стери­лизации, добавляя к ней антибиотики и антисептики. Подготав­ливают жидкую питательную среду и посевной материал культу­ры дрожжей в разных емкостях — ферментере и посевном аппа­рате.

В качестве посевного материала используют споры Е. ashbyii, выращенные на пшене (7 —8 дней при 29 — 30 °С). После стерили­зации жидкий посевной материал подается в ферментер. Процесс ферментации грибов для получения кормового рибофлавина длится 3 суток при температуре 28 — 30 °С. Концентрация рибофлавина в культуральной жидкости может достигать 1,4 мг/мл. По заверше­нии процесса ферментации культуральную жидкость концентри­руют в вакууме, высушивают на распылительной сушилке (влаж­ность 5— 10%) и смешивают с наполнителями.

В 1983 г. во ВНИИ генетики микроорганизмов сконструирован рекомбинантный штамм продуцента Bacillus subtilis, характеризу­ющийся увеличенной дозой оперонов, которые контролируют син­тез рибофлавина. Клонированием генов рибофлавинового оперо- на в одной из созданных плазмид был получен производственный штамм-продуцент витамина В₂, способный синтезировать втрое больше по сравнению с Е. ashbyii количество рибофлавина всего за 40 ч ферментации.

Получение витамина В₁₂ (Соа[а-(5,6-диметилбензимидазолил)]- Сор — цианокобамид). Витамин В₁₂ открыт в 1948 г. одновременно в США и Англии. В 1972 г. в Гарвардском университете был осуще­ствлен химический синтез корриноидного предшественника ви­тамина В₁₂. Химический синтез корнестерона — структурного эле­мента корринового кольца витамина, включающий 37 стадий, в крупных масштабах не воспроизведен из-за сложности процесса.

Витамин В₁₂ регулирует углеводный и липидный обмен, уча­ствует в метаболизме незаменимых аминокислот, пуриновых и пири- мидиновых оснований, стимулирует образование предшественни­ков гемоглобина в костном мозге; применяется в медицине для лечения злокачественной анемии, лучевой болезни, заболеваний печени, полиневрита и т. п. Добавление витамина к кормам способ­ствует более полноценному усвоению растительных белков и повыша­ет продуктивность сельскохозяйственных животных на 10 — 15 %.

тивирования на непрерывный процесс. В последние годы исследу­ется возможность получения витамина с использованием иммо­билизованных клеток пропионовокислых бактерий.

Для нужд животноводства сотрудниками Института биохимии им. А. Н. Баха РАН разработана более простая и дешевая техноло­гия получения витамина В₁₂, в создание которой большой вклад внесли работы В.Н.Букина, В.Я.Быховского, И.С.Логоткина, Е. С. Панцхавы и др.

По указанной технологии ферментацию осуществляет слож­ный биоценоз термофильных микроорганизмов, производящих ме­тановое брожение. Комплекс микроорганизмов включает целлю- лозоразлагающие, углеводсбраживающие, аммонифицирующие, сульфитвосстанавливающие и метанообразующие бактерии. На первой фазе процесса (10 — 12 дней) развиваются термофильные углеводсбраживающие и аммонифицирующие бактерии. При этом в слабокислой среде (рН 5,0—7,0) органические соединения пре­вращаются в жирные кислоты и аммиак. На второй фазе, когда среду подщелачивают до рН 8,5, в биоценозе преобладают мета­нообразующие бактерии, которые сбраживают возникающие на первой фазе продукты до метана и диоксида углерода. Именно метанообразующие бактерии — главные продуценты витамина. Обо­гащение сред очищенными культурами метанообразующих бакте­рий увеличивает выход активных форм витамина В₁₂.

Источником углерода в питательной среде служит ацетонобути- ловая и спиртовая барда, которую представляют заводы, перераба­тывающие зерно и мелассу. Для оптимизации питательной среды в нее добавляют соединения кобальта (хлорид кобальта — 4 г/м³), который входит в состав молекулы витамина В₁₂, и субстраты для роста метанообразующих бактерий — низшие жирные кислоты и низшие спирты, что позволяет значительно повысить выход вита­мина.

Подготовленное сырье освобождают в декантаторе от взвешен­ных частиц и непрерывно подают в нижнюю часть ферментера (метантенка) емкостью 4200 м³. Одновременно в ферментер по­ступает посевной материал культуры микроорганизмов, предва­рительно выращенный в специальных аппаратах. Для выращива­ния продуцента требуются облигатно анаэробные условия, ибо даже следы кислорода подавляют рост бактерий. При создании анаэробных условий в среду подают диоксид углерода или газы, выделяющиеся в процессе ферментации. Ежедневно из метантен­ка отбирают 25 —30 % объема среды. Продукт ферментации стаби­лизируют, подкисляя соляной или фосфорной кислотой до рН 6,3 — 6,5 и добавляя 0,2 — 0,25 % сульфита натрия, что предотвра­щает разрушение витамина при тепловой обработке, особенно су­щественное в щелочной среде. В дальнейшем отобранная часть куль­туральной жидкости дегазируется, упаривается в вакууме; кон-

3.4.3. Производство органических кислот

В настоящее время биотехнологическими способами в промыш­ленных масштабах синтезируют ряд органических кислот. Из них лимонную, глюконовую, кетоглюконовую и итаконовую кислоты получают лишь микробиологическим способом, молочную, салици­ловую и уксусную — как химическим, так и микробиологическим способами, а яблочную — химическим и энзиматическим путем.

Получение уксусной кислоты. Уксусная кислота имеет наибо­лее важное значение среди всех органических кислот. Ее исполь­зуют при выработке многих химических веществ, включая кау­чук, пластмассы, волокна, инсектициды. Микробиологический способ получения уксусной кислоты состоит в конверсии этанола в уксусную кислоту при участии бактерий штаммов Acetobacter и Gluconobacter:

Алкогольдегидрогеназа Альдегиддегидрогеназа

+НАД⁺ +НАД⁺+Н₂0

СН₃СН₂ОН СНзСНО ——----- ^СНзСООН

Этанол ~НАДН+Н -НАДН+Н+ _{уксусн£Ш}

кислота

Процесс идет в анаэробных условиях в режиме непрерывного культивирования продуцента. Для роста бактерии Acetobacter aceti используют питательные среды, содержащие 6 — 12% этилового спирта, 1 % бактериального гидролизата, 0,05 % дигидрофосфата калия, 0,1% гидрофосфата аммония и 0,05% сульфата магния. Максимальная удельная активность непрерывной культуры A. aceti (количество микрограммов субстрата, подвергшегося окислению 1мкг биомассы за 1 мин) достигается к 20-м суткам культивиро­вания при концентрации спирта 7 % и составляет 3,0 ед./мг.

Получение лимонной кислоты. Лимонную кислоту широко ис­пользуют в пищевой, фармацевтической и косметической промыш­ленности. Ею заменяют фосфаты в составе детергентов, так как она полностью метаболизируется живыми организмами. Лимон­ная кислота образует хелаты с металлами, поэтому ее применя­ют для их очистки. Объем мирового производства цитрата состав­ляет 400 тыс. т/год. Самый крупный производитель лимонной кисло­ты — США. Производство лимонной кислоты принадлежит к числу старейших промышленных микробиологических процессов: оно было организовано в 1893 г. С этого момента параллельно развитию фундаментальной микробиологии велись изыскания оптимальных продуцентов и технологических вариантов процесса ферментации.

Для промышленного производства лимонной кислоты ис­пользуют главным образом культуру гриба Aspergillus niger, а также A. wentii.

Метаболическим источником лимонной кислоты в организме служит цикл трикарбоновых кислот — составная часть цикла Креб-
са. Суммарное уравнение химических процессов этого цикла сле­дующее:

СН₃С ~ SKoA + ЗНАД⁺ + ФАД + ГДФ + Н₃Р0₄ +4Н₂0 —- О

— 2СО_г + ЗНАДН + ЗН⁺+ ФАДН₂ + ГТФ + HSKoA

Реакция образования лимонной кислоты, катализируемая цит- ратсинтазой, открывает цикл Кребса, в котором цитрат посте­пенно окисляется до щавелево-уксусной кислоты (ЩУК). ЩУК снова конденсируется с ацетил-КоА, так что вновь образуется лимонная кислота (рис. 3.5). Цитратсинтаза определяет скорость реакций, составляющих цикл Кребса. Активность фермента зави­сит от концентрации ЩУК, содержание которой может поддер­живаться за счет функционирования конститутивной пируваткар- боксилазы, обеспечивающей переключение в аэробных условиях процессов гликолиза и глиоксилевого цикла. Активность цитрат-

н-Алканы (С₉—С30)

I

Фруктозо-6-фосфат

I

Фруктозо-1,6-дифосфат

Сукцинил-КоА- ингибирование Рис. 3.5. Схема биосинтеза лимонной кислоты

синтазы тормозится НАДН и сукцинил-КоА. Скорость оборота цикла Кребса определяется поддержанием необходимого уровня окисленных форм коферментов дегидрогеназ (НАД⁺ и ФАД; см. уравнение реакции), поэтому высокий выход цитрата получается лишь при условии хорошей аэрации. Накопление в культуральной среде существенных количеств цитрата — промежуточного соеди­нения цикла Кребса — невыгодно для организма и является след­ствием дисбаланса метаболизма или нарушения его генетической природы. Рост культуры грибов обычно регулируют путем измене­ния содержания фосфата, ионов марганца, железа и цинка в среде. Дефицит фосфата ведет к сверхпродукции цитрата. Роль ионов ме­таллов не до конца установлена. Считают, что дефицит ионов ме­таллов влияет на свойства клеточных мембран и морфологию гиф.

Процесс ферментации, ведущий к образованию лимонной кислоты, проводят при низких значениях рН (3—4), что облегча­ет поддержание стерильных условий ферментации и уменьшает возможность образования побочных продуктов. В более щелочной среде происходит накопление щавелевой и глюконовой кислот. Предполагают, что в кислой среде стимулируется гликолиз, что обеспечивает направление потока углерода в цикл Кребса.

Питательные среды для культивирования продуцентов лимон­ной кислоты в качестве источника углерода содержат дешевое уг­леводное сырье: мелассу, крахмал и глюкозный сироп. Гриб A. niger чаще всего выращивают на мелассе. Гриб Trichoderma viride синтези­рует значительные количества цитрата из глюкозы, что позволяет использовать для этого процесса целлюлозу. Предложены штаммы бактерий (Corynebacterium, Arthrobacterium и Brevibacterium) и дрож­жей рода Candida, осуществляющие процесс на основе н-парафи­нов (С₉—С₃₀), которые пока широко не внедрены в промышлен­ность.

Существует несколько технологических вариантов промышлен­ного производства лимонной кислоты. Первоначально был разра­ботан вариант процесса, основывающийся на поверхностной фер­ментации, позднее — на глубинном культивировании. Последнее ведется в две стадии: на первой стадии идет рост мицелия, а на второй, после выхода культуры в стационарную фазу — интен­сивный синтез лимонной кислоты. В конце ферментации массу мицелия отделяют путем фильтрования и промывают. Затем при рН < 3,0 в виде кальциевой соли осаждают щавелевую кислоту, а из маточного раствора выделяют лимонную кислоту в форме сред­ней соли, кристаллизующейся в комплексе с четырьмя молекула­ми воды. Свободную кислоту выделяют из промытых кристаллов соли после их обработки сульфатом кальция. Высокоочищенные препараты лимонной кислоты получают после дополнительной процедуры очистки методом ионообменной хроматографии. Вы­ход продукта составляет 85 %.

С 20-х годов XX в. налажено промышленное производство D- глюконовой кислоты из глюкозы при участии A. niger. При этом за 48 ч ферментации культуры гриба степень превращения субстрата составляет 90 %. Глюконат натрия, в виде которого обычно выде­ляют глюконовую кислоту, используют для извлечения металлов, борьбы со ржавчиной, как моющее средство и в качестве меди­цинского препарата. С участием культуры грибов из рода Aspergillus путем ферментации глюкозы получают с высоким выходом ита- коновую кислоту, использующуюся для производства пластмасс и красителей.

Новые возможности для интенсификации производственных процессов получения органических кислот открывает примене­ние иммобилизованных ферментов и клеток микроорганизмов.

3.5. БИОТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ

Принципы получения вторичных метаболитов основаны на особенностях их образования клетками микроорганизмов. Биосин­тез вторичных метаболитов фазоспецифичен и происходит по за­вершении стадии роста, в идиофазе, благодаря чему их еще назы­вают идиолитами (см. с. 32). Среди вторичных метаболитов веду­щее место по объему производства занимают антибиотики.

3.5.1. Получение антибиотиков

В мире ежегодно производится антибиотиков почти на 20 млрд долларов. К числу антибиотиков относятся важнейшие противо- микробные и противоопухолевые препараты. Открытие антибио­тиков произвело переворот в лечении инфекционных заболева­ний. Ушли в прошлое представления о неизлечимости многих бак­териальных инфекций (туберкулез, сепсис, сифилис и др.). Анти­биотики применяют в ряде отраслей народного хозяйства (расте­ниеводство, животноводство, ветеринария, пищевая промышлен­ность и др.), где они используются более широко, чем в медици­не. Организация крупномасштабного производства антибиотиков сыграла решающую роль в становлении промышленной биотех­нологии.

К антибиотикам относятся низкомолекулярные эффекторы изначально природного происхождения, способные подавлять рост живых клеток. Антибиотики, продуцируемые растительными объек­тами, называют фитонцидами. Вопрос о физиологических функ­циях антибиотиков, их месте в метаболизме и процессах эволю­ции окончательно не решен. Антибиотики возникли в борьбе за существование почвенных биоценозов, поэтому многие из них
служат средствами нападения и защиты, т. е. представляют собой своеобразное химическое «оружие» клетки. Однако эти функции у антибиотиков не единственны. Известно, что они могут участво­вать в процессах детоксикации вредных метаболитов, контроли­ровать некоторые стороны обмена веществ и целые процессы раз­вития, например дифференцировку клеток, служить запасными питательными веществами. Некоторые исследователи рассматри­вают антибиотики как случайные вещества, обладающие полез­ными свойствами, другие считают их реликтовыми молекулами, вытесненными в ходе эволюции продуктами рибосомального син­теза, но и до сих пор сохранившими способность вмешиваться в биохимические процессы.

Способность нитчатого гриба зеленой плесени Penicillium notatum вызывать гибель микроорганизмов впервые была установлена в 1928 г. английским микробиологом А. Флеммингом. Однако лечеб­ные свойства этой плесени были описаны еще в 1871 г. русским дерматологом А. Г. Полотебновым. Количество открываемых анти­биотиков постоянно растет. В 1940 г. было известно всего 6 антиби­отиков, а в настоящее время описано более 12 000 аналогичных соединений, из которых в клинике применяют около 200 препара­тов. 97 % известных антибиотиков токсичны, поэтому в практике не используются. В химическом отношении они представляют сборную группу органических веществ. В зависимости от химической природы и ряда других свойств известные антибиотики делят на ряд классов:

1. Р-Лактамные (пенициллины, цефалоспорины) составляют более 50 % рынка антибиотиков.

2. Тетрациклины (тетрациклин, морфоциклин, метациклин).

3. Макролиды (эритромицин, олеандомицин).

4. Аминогликозиды (гентамицин, амикацин).

5. Гликопептиды (ванкомицин, ристомицин).

6. Амфениколы (левомицетин).

7. Линкосамиды (линкомицин).

8. Полиеновые [противогрибковые (нистатин, леворин)].

9. Противоопухолевые (блеомицин) и др.

Большой вклад в установление структуры ряда антибиотиков внесли М. М. Шемякин, Ю. А. Овчинников, В. Т. Иванов, А. С. Хох­лов, Г.Б.Локшин, М.Н.Колосов, Ю.А.Берлин, Е.С. Есипов, А.Д. Кузовнов.

Химические формулы наиболее распространенных антибиоти­ков следующие:

S

О

Бензилпенициллин

но^ сн,

лш

ЛЛ

Левомицетин

D—фен —про — вал —орн — лей / \ лей— орн — вал — про — D — фен

Грамицидин

По типу действия антибиотики делят на бактерицидные (лак- тамные, аминогликозиды), вызывающие гибель микроорганизмов, и бактериостатические (макролиды, тетрациклины, левомицетин), нарушающие способность микроорганизмов делиться. По спектру действия различают антибиотики узкого и широкого действия. К последним относят тетрациклины, макролиды, аминогликозиды, которые особенно полезны в случае неидентифицированных воз­будителей болезни, однако при длительном применении они вы­зывают у пациентов дисбактериоз.

В последние годы достигнуты большие успехи в расшифровке молекулярного механизма действия антибиотиков. Наиболее яркая особеннность антибиотиков — исключительная специфичность их действия. По выражению П. Эрлиха, антибиотики — это магичес­кие пули. Специфика действия их состоит в избирательном подав­лении этими эффекторами одного или нескольких процессов лишь у некоторых микроорганизмов. Таким образом, антибиотики бло­кируют метаболические мишени в клетках-мишенях. В зависимости от специфики действия антибиотиков на молекулярном уровне раз­личают следующие группы соединений, вызывающие у бактерий:

1) нарушение биосинтеза пептидогликанов клеточной стенки (пенициллины, ванкомицин, цефалоспорины);

2) нарушение отдельных этапов процессов трансляции (амфени- колы, аминогликозиды, тетрациклины, макролиды, линкосамиды);

3) повреждения цитоплазматической мембраны (грамицидин, полимиксины);

4) нарушение биосинтеза нуклеиновых кислот (рифамицины, актиномицин D, противоопухолевые антибиотики);

5) нарушение энергетического обмена (олигомицин, хлоргек- сидин).

Антибиотики широко используют в качестве молекулярных инструментов при исследовании фундаментальных проблем био­логии, таких, как расшифровка тончайших механизмов биосин­теза белка, нуклеиновых кислот и структуры клеточных стенок бактерий, создание моделей транспорта ионов через биологичес­кие мембраны и др.

Изыскание новых антибиотиков обусловлено как потребностя­ми практики, так и накоплением резистентных форм микроорга­низмов по отношению ко многим антибиотикам. Устойчивость бактерий к пенициллинам и цефалоспоринам создает присутству­ющий в их клетках энзим лактамаза (пенициллиназа). Фермент гидролизует амидную связь (3-лактамного цикла в молекуле анти­биотика с образованием пенициллиновой кислоты, которая пол­ностью лишена антимикробной активности:

Специальное изучение объема и потенциала защитных свойств микроорганизмов показало, что их резистентность к антибиоти­кам имеет глобальный характер и обеспечивается как разнообра­зием фенотипов резистентности, так и разнообразием и стабиль­ностью систем горизонтального генного транспорта. Поэтому глав­ное направление получения новых антибиотиков состоит не в от­крытии новых соединений, а в химической трансформации при­родных молекул для создания полусинтетических антибиотиков, характеризующихся значительно меньшей резистентностью и ток­сичностью, но более широким спектром действия, большим вре­менем жизни, химической и биологической устойчивостью. Важ­ный подход на пути получения устойчивых аналогов антибиоти­ков — использование природных ингибиторов (3-лактамаз — кла- вулановой и оливановой кислот.

Методы получения антибиотиков путем химического синтеза чрезвычайно сложны и не могут конкурировать с их биосинтезом методами биотехнологии. Существует несколько способов получе­ния как природных, так и полусинтетических антибиотиков. На­правленный биосинтез антибиотиков осуществляется путем пря­мой ферментации микроорганизма — продуцента с подходящим
нии природы его ацильнои группировки при сохранении в неиз­менном виде ядра пенициллина — 6-аминопенициллановой кис­лоты (6-АПК). В промышленности 6-АПК получают путем гидро­лиза природных пенициллинов с помощью специфического фермента — пенициллинацилазы, образующейся с высоким выхо­дом в процессе ферментации ряда штаммов микроорганизмов. Аци- лазы различают по их субстратной специфичности. Некоторые из ацилаз способны катализировать и обратные реакции — процессы ацилирования аминогруппы 6-АПК с образованием модифициро­ванного пенициллина. Таким путем было получено более 40 ООО по­лусинтетических пенициллинов. Существенно, что во многих слу­чаях 6-АПК не выделяют из культуральной жидкости, например при превращении бензилпенициллина в ампициллин:

0=с n Бензилпенициллин

+ Н₂0, пенициллин- ацилаза

сн₃ сн₃ соон

Бензилпенициллин гидролизуют ацилазой мутанта Kluyvera citrophi- la при рН 7,8 — 8,0 и температуре 40—50 "С. Затем в ферментер вно­сят мутант Pseudomonas melanogenum и фенилглицин. Условия фермен­тации изменяют таким образом (рН 5,0 — 5,5), чтобы ацилаза вто­рого мутантного организма осуществляла синтез ампициллина: