БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ 14 страница

Сомаклональные вариации нельзя рассматривать как случай­ные спонтанно возникающие мутации. Генетические изменения, характерные для сомаклональных вариаций, сложны и носят ком­плексный характер. Частота таких генетических изменений на три порядка превышает частоту спонтанных мутаций. Кроме того, сома­клональные варианты отличаются от исходного растения не толь­ко качественными моногенными признаками, но и количествен­ными — полигенными (интенсивность роста, продуктивность, устойчивость к неблагоприятным факторам внешней среды).

Отмечены случаи появления сомаклональных вариантов, сочетающих признаки, которые невозможно или трудно соеди­нить в одном генотипе традиционным селекционным путем. Так, Л.А.Кучеренко (1986) выделила из сомаклональных вариантов, возникших в каллусной культуре риса, растения, сочетавшие ско­роспелость и длиннозерность. На их основе за короткий срок был. создан новый сорт риса.

По-разному сказываются на генетических изменениях и, следо­вательно, на появлении сомаклональных вариаций различные типы морфогенеза. Экспериментально установлено, что при соматичес­ком эмбриогенезе цикл «клетка — растение» совершается значи­тельно быстрее, чем при органогенезе. Поэтому степень различия между полученным и исходным родительским генотипом в случае органогенеза может быть значительно выше, чем при эмбриоге­незе.

Источником генетического разнообразия растительного мате­риала могут быть не только сомаклональные вариации, но и му­тагенез, в несколько раз повышающий образование стабильно устойчивых по искомым признакам клонов клеток.

После получения различных сомаклональных вариаций от ис­ходного растения наступает следующий этап — отбор необходи­мых сочетаний признаков. Данный вопрос решается с помощью клеточной селекции, которую проводят практически на любом объекте, введенном в культуру in vitro. Однако удобнее использо­вать суспензионную культуру или изолированные протопласты. Преимущество этих объектов состоит в быстром росте культуры и равномерном действии селективного фактора на все клетки. Для отбора сомаклональных вариаций соответствующие селективные факторы (соли в высоких концентрациях, гербициды и др.) до­бавляют в питательную среду для выращивания культуры клеток либо растущие культуры помещают в селективные условия (низ­кая или высокая температура, освещенность и т.д.). Существует несколько методов клеточной селекции:

1. Прямая (позитивная) селекция, при которой выживает только заданный тип мутантных клеток.

2. Непрямая (негативная) селекция, которая ведет к гибели деля­щихся клеток дикого типа и выживанию метаболически неактив­ных клеток. Этот прием требует дополнительной идентификации мутационных изменений у выживших клеток.

3. Тотальная селекция, при которой индивидуально тестируют­ся все клеточные клоны.

4. Визуальная селекция и неселективный отбор, когда необхо­димая вариантная линия выбирается среди прочих визуально или с помощью биохимических методов.

Для отбора клеток, устойчивых к неблагоприятным или стрес­совым факторам, наиболее часто применяют прямую селекцию. После выбора нужной популяции необходимо проверить стабиль­ность устойчивости к неблагоприятному фактору. Это длительный процесс, включающий многочисленные циклы выращивания и пересадки клеток на среды, содержащие селективный фактор или без него. Из стабильных клонов необходимо попытаться регенери­ровать растения. Получение растений-регенерантов, а также гиб­ридологический анализ подтверждают генетическую природу при-
заряд, который вызывает их взаимное отталкивание. Для слияния это отталкивание необходимо преодолеть специальными приема­ми, способствующими снятию или перераспределению поверх­ностного заряда мембран. Впервые искусственное слияние прото­пластов с помощью индуктора слияния (фьюзогена) было осу­ществлено в 1970 г. Коккингом и его сотрудниками. В настоящее время в качестве эффективных фьюзогенов используют полиэти- ленгликоль (ПЭГ) и растворы с рН 9—11 и высокой концентра­цией ионов кальция. Согласно одной из гипотез, объясняющих сли­яние протопластов при использовании ПЭГ, высокая концентра­ция этого вещества (20—30 %) способствует поглощению всей сво­бодной воды между протопластами, вызывая их слипание в резуль­тате дегидратации. Кроме того, поглощение свободной воды инду­цирует образование пор в мембране, через которые перетекает внут­риклеточное содержимое. Если повреждения мембран обратимы, слипшиеся протопласты регенерируют клеточную стенку (рис. 6.7).

Кроме того, существует физический фактор — импульсы элек­трического тока, который также заставляет протопласты сливать­ся. Обработка электрическими импульсами, как и обработка ПЭГ, приводит к обратимому повреждению мембран. Применение пе­ременного тока вызывает диэлектрофорез, и протопласты, нахо­дящиеся между электродами, выстраиваются в ряд, примыкая друг к другу своими полярными поверхностями. Импульс постоянного
тока приводит к образованию пор, через которые происходит сли­яние (рис. 6.8).

При соматической гибридизации развиваются клетки двух ти­пов: гибриды и цибриды. При образовании гибридов объединяет­ся ядерный геном обеих клеток. Цибридная клетка содержит ци­топлазму обоих партнеров, а ядро — одного. Такой результат дос­тигается при деградации одного из ядер после слияния или в том случае, если один из протопластов был лишен ядра.

Первый неполовой гибрид высших растений был получен в 1972 г. при слиянии изолированных протопластов двух видов таба­ка: Nicotiana glauca и Nicotiana langsdorfii. В настоящее время полу­чено много межвидовых, межсемейственных и межтрибных гиб­ридов, значительную часть которых нельзя считать нормальными растениями, а некоторые гибриды (гибрид арабидопсиса и тур­непса) представляют собой растения-монстры. Возникающие ано­малии — результат хромосомной несбалансированности. Описаны случаи возникновения гибридов между протопластами эритроци­тов крысы и дрожжевых клеток, моркови и человека и др. Любые исследования, любые манипуляции в области создания новых ге­нотипов должны быть тщательно и всесторонне продуманы, а ученые должны помнить об ответственности и научной этике. Профессор Колумбийского университета Э. Чаргафф предупреж­дал о том, что «в тысяче опытов, вероятно, ничего не случится,

Рис. 6.8. Схема слипания протопластов под действием электрического поля (по Х.Борнман, 1991): / — изолированные протопласты; 2 — слипание протопластов полярными по­верхностями; 3 — образование пор в мембранах под действием сильного импуль­са постоянного тока; 4 —смешивание цитоплазмы; 5 — образование цибридных (гибридных) протопластов

hq затем в одном каком-то случае произойдет нечто очень непри­ятное». Он был «убежден, что именно попытка преобразовать или перехитрить природу почти привела к ее гибели».

Введение в протопласты макромолекул, клеточных органелл и бактериальных клеток. Чужеродный генетический материал мож­но переносить в клетку не только при соматической гибридиза­ции, но и при непосредственном введении ДНК или органелл, содержащих ДНК, в изолированные протопласты. Работы в этом направлении начаты не так давно, но уже получены интересные результаты. Так, поглощение экзогенных макромолекул ДНК по­казано у протопластов петунии, сои, моркови. Проведена транс­плантация органелл (ядер, митохондрий, хлоропластов) в про­топласты растений. Наибольшую важность представляют опыты по трансплантации хлоропластов одних растений в клетки других. П.Карлсон провел опыты по введению хлоропластов нормально­го зеленого растения Nicotiana suaveolens в протопласты пестроли­стного мутанта N. tabacum. В результате культивирования прото­пластов были получены зеленые каллусы, из которых регенери­ровали растение, оказавшееся пестролистным. Для того чтобы понять, содержит растение-регенерант элементы геномов двух видов Табаков или только одного, проанализировали белковую фракцию I, в которую входит ключевой фермент цикла Кальви­на — рибулозодифосфаткарбоксилаза (РДФ-карбоксилаза). Этот фермент состоит из двух больших субъединиц и двух малых. Боль­шие субъединицы кодируются геномом хлоропластов, малые — ядерными генами. Анализ состава белковой фракции I растения- регенеранта показал присутствие полипептидов, характерных и для пластид N. tabacum, и для пластид N. suaveolens. Перспектив­ность работ по трансплантации хлоропластов заключается в том, что введение высокоэффективных хлоропластов может способство­вать активации фотосинтеза и повышению продуктивности дру­гих растений.

Среди бактериальных клеток к созданию искусственных ассо­циаций с растительными клетками наиболее способны цианобак- терии. Это может быть связано с тем, что они часто вступают в симбиотические отношения с другими организмами; что древние цианобактерии, вероятно, участвовали в формировании расти­тельных клеток в процессе эволюции; что цианобактерии способ­ны выделять в среду разнообразные вещества: углеводы, амино­кислоты, вещества гормональной природы и другие, которые могут быть использованы культивируемыми клетками растений. Расти­тельные клетки способны потреблять кислород, образующийся в процессе фотосинтеза цианобактерий, а цианобактерии потреб­ляют диоксид углерода, выделяемый растительными клетками при дыхании. Кроме того, азотфиксирующие цианобактерии могут накапливать азот в почве и обеспечивать до 15 % потребностей растений в нем. Например, симбиоз папоротника Azolla с Anabaena azollae применяют в сельском хозяйстве в качестве источника свя­занного азота на рисовых полях.

Большой интерес вызывает тот факт, что цианобактерии могут выступать в качестве фототрофного компонента ассоциаций с расти­тельными клетками. Использование питательных сред, в которых не хватает источника углерода, показало, что прирост раститель­ных клеток может быть обеспечен за счет усвоения ими продуктов фотосинтеза цианобактерий или их лизиса. Однако не все сочета­ния растений и цианобактерий оказывают взаимное благотворное влияние. Выявлена видовая специфичность взаимодействия партне­ров. Так, клетки культуры мака и Anabaena variabilis взаимно подав­ляли рост друг друга. В то же время на рост культивируемых клеток табака, женьшеня, диоскореи цианобактерии оказывали стимули­рующее влияние. В большинстве случаев существенное влияние од­ного партнера на ростовые процессы другого не выявлялось.

Совместное выращивание растительных клеток и цианобакте­рий имеет еще одну важную особенность. На дефицитной среде оно может приводить к увеличению синтеза вторичных метаболитов по сравнению с их накоплением в монокультуре на полной среде.

Введение азотфиксирующих цианобактерий в культуру расти­тельных клеток могло бы наряду с применением методов генной инженерии решить проблему азотфиксации. Показано, что в сме­шанных культурах каллуса табака и цианобактерий на среде Му- расиге и Скуга формировались побеги регенерантов табака с уча­стками сине-зеленого цвета, где локализовались цианобактерии. Вероятно, большие межклетники в каллусах табака способствуют проникновению цианобактерий сначала в межклетники каллус­ной ткани и в область меристемоидов, а затем — в формирующи­еся побеги. Цианобактерии сохранялись на поверхности и в тка­нях стебля и листьев при многочисленных пересадках, образова­нии вторичных каллусов и последующей регенерации из них по­бегов, т. е. образовывалась устойчивая ассоциация растительной и бактериальной клетки. Азотфиксирующие цианобактерии обеспе­чивали рост растительных клеток в суспензионных и каллусных смешанных культурах на питательных средах, дефицитных по азо­ту, а в ассоциациях с растениями — и в песчаной культуре, не содержащей связанного азота. Это действие обеспечивается, по- видимому, за счет продуктов азотфиксации, выделяющихся в среду. В свою очередь, цианобактерии могут получать от растений угле­воды. Причем цианобактерии, предварительно культивируемые с растительными клетками, получают от побегов в 2,5 раза больше меченых соединений углерода по сравнению с цианобактериями, взятыми из чистой культуры. В результате такого потребления ра­стение-хозяин может значительно снизить интенсивность собствен­ных ростовых процессов. Поэтому прежде чем приступить к прак­тическому использованию искусственных ассоциаций, необходи­мо решить проблему обеспечения азотфиксирующего симбионта органическими веществами без нанесения существенного ущерба растению.

6.8.3. Клональное микроразмножение и оздоровление растений

Клональным микроразмножением называют неполовое раз­множение растений с помощью метода культуры тканей, позво­ляющее получать растения идентичные исходному. В основе по­лучения таких растений лежит способность соматических клеток растений полностью реализовывать свой потенциал развития, т.е. свойство тотипотентности. Метод клонального микроразмно­жения получает все более широкое распространение во всем мире. В большинстве стран эта технология приобрела коммерческий ха­рактер.

В России первые работы по клональному микроразмножению были проведены в 60-х годах XX в. в лаборатории Р. Г. Бутенко (Институт физиологии растений им. К.А.Тимирязева). В настоя­щее время созданы и развиваются лаборатории клонального мик­роразмножения, связанные с нуждами селекции, размножением декоративных, лекарственных и других растений. Кроме того, тех­нология используется для размножения лучших экземпляров взрос­лых лесных деревьев, особенно хвойных, для сохранения редких и исчезающих видов растений.

Свое название эта технология размножения получила от тер­мина «клон» (от греч. clon — отпрыск), который предложил Веб- бер в 1903 г. Клональное микроразмножение имеет существенные преимущества перед традиционными способами размножения:

1. Высокий коэффициент размножения. Одно растение герберы за год при микроклональном размножении дает до 1 млн новых растений, тогда как при обычных способах размножения — толь­ко 50 — 100 растений. Большинство культивируемых в настоящее время сортов лилий размножается только вегетативно. Луковички возникают на материнских луковицах или на побеге в небольших количествах. Технология микроклонального размножения позво­ляет получить из одной чешуи луковицы за 6 месяцев 10⁵ новых растений (сорт Red Carpet).

2. Получение генетически однородного посадочного материала.

3. Возможность оздоровления растений, освобождения их от вирусов благодаря клонированию меристематических тканей.

4. Возможность размножения растений, которые в естествен­ных условиях репродуцируются с большим трудом.

5. Воспроизведение посадочного материала круглый год, что значительно экономит площади, занимаемые маточными и раз­множаемыми растениями.

6. Сокращение продолжительности селекционного периода, ус­корение перехода растений от ювенильной фазы развития к реп­родуктивной.

Технология микроклонального размножения. Обязательное ус­ловие клонального микроразмножения — использование объек­тов, полностью сохраняющих генетическую стабильность на всех этапах процесса, от экспланта до растений в поле. Такому требо­ванию удовлетворяют апексы и пазушные почки органов стебле­вого происхождения, т. е. меристематические ткани. Их устойчи­вость к генетическим изменениям, вероятно, связана с высокой активностью систем репарации ДНК, а также с негативной се­лекцией измененных клеток.

Процесс клонального микроразмножения можно подразделить на 3 этапа:

1. Получение хорошо растущей стерильной культуры. На этом этапе необходимо правильно выбрать растение-донор, получить свободную от инфекции культуру, добиться ее выживания и быс­трого роста на питательной среде.

2. Собственно размножение, осуществляемое несколькими спо­собами:

активизация пазушных меристем;

индукция образования адвентивных почек тканями листа, стеб­ля, чешуйками и донцем луковиц, корневищем и зачатками соцве­тий без первоначального образования каллусной ткани;

микрочеренкование побега, сохраняющего апикальное доми­нирование;

стимуляция образования микроклубней и микролуковичек;

индукция соматического эмбриогенеза.

3. Подготовка к высадке в поле или к реализации. Это очень важный этап, во время которого в теплице укорененные расте­ния, полученные in vitro, адаптируют к новым условиям внешней среды: проводят закаливание растений, повышают их устойчи­вость к патогенным микроорганизмам и различным неблагопри­ятным факторам внешней среды. Существует много различных способов адаптирования растений к пересадке in vivo. Это под­бор почвенного субстрата, создание определенной влажности, обработка химическими веществами (глицерин, парафин) для предотвращения обезвоживания листьев. Некоторые древесные ра­стения лучше приживаются, если их заразить in vitro микоризооб- разующими грибами (Е.А.Калашникова, 1993). Упрощенный спо­соб адаптации пробирочных растений винограда был разработан в Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН. Адап­тацию проводят прямо в пробирках, снимая с них пробки, когда растения винограда дорастают до верха пробирки. Через 1,5 — 2 недели, когда верхушки побега с двумя развитыми листьями по­являются над пробиркой, растение готово к пересадке в почву.

Для предотвращения механических повреждений корневой систе­мы растение пересаживают в почву вместе с агаром, заглубляя его так, что над поверхностью почвы остаются только 2 развитых листа, которые выросли из пробирки и уже адаптировались к вне­шним условиям. Такая методика позволяет значительно упростить, ускорить и удешевить этап акклиматизации растений.

Клональное микроразмножение растений проводят разными способами. Первый и основной способ — активизация пазушных меристем. Он состоит в снятии апикального доминирования и активизации развития меристем, существующих в растении. Этот способ основной и в обычном вегетативном размножении. И на интактном растении, и в случае клонирования снятие апикально­го доминирования достигается или удалением апикальной мери­стемы побега, или благодаря действию цитокинина. При клони­ровании цитокинины (6-бензиламинопурин, 6-фурфуриламино- пурин, зеатин) добавляют в питательную среду, что приводит к развитию многочисленных пазушных побегов. Эти побеги отделя­ют от первичного экспланта и культивируют на свежей питатель­ной среде. Активизацию пазушных меристем широко используют в промышленном размножении овощных сельскохозяйственных культур (картофель, томаты, огурцы, сахарная свекла, топинам­бур и др.), цветов (гвоздика, роза, гербера), плодовых и ягод­ных культур (яблоня, вишня, малина, крыжовник и др.), древес­ных растений (туя, можжевельник и др.). Однако бесконечно раз­множать таким способом растения нельзя, поскольку длительное воздействие цитокининов, входящих в состав питательных сред, вызывает аномалии в морфологии стебля, потерю способности побегов к укоренению, иногда — гибель растений. В опытах с размножением земляники было показано, что при клонировании необходимо чередовать 2 — 3 цикла получения побегов с их укоре­нением.

Второй способ — индукция развития адвентивных почек, т. е. по­чек, возникающих из растительных клеток и тканей, которые их обычно не образуют. Этот метод в значительной мере обусловлен тотипотентностью клеток. Почти любой орган или ткань расте­ния, свободные от инфекции, могут быть использованы в каче­стве экспланта и в определенных условиях образуют адвентивные почки. Данный процесс вызывают внесением в питательную среду определенных концентраций цитокининов и ауксинов, причем цитокинина должно быть гораздо больше, чем ауксина. Это наи­более распространенный способ микроразмножения высших рас­тений. Развивая адвентивные почки на апикальных и пазушных меристемах, размножают растения томата, лука, чеснока; на сег­ментах листовых пластинок — салат, глоксинию, фиалки; на тка­нях донца луковиц — лук, чеснок, гладиолусы, тюльпаны и дру­гие луковичные растения.

1 ПС

Факторы, влияющие на клональное микроразмножение. Пита­тельная среда. Состав питательной среды — один из наиболее важ­ных факторов при микроразмножении. Обычно используют стан­дартные среды: Мурасиге-Скуга, Нича и др., но с добавлением на каждом этапе различных веществ. На первом этапе в питатель­ную среду часто вносят антиоксиданты, чтобы предотвратить ги­бель клеток из-за активизации гидролитических ферментов. Осо­бое значение имеют концентрация и соотношение фитогормонов в среде. Например, на втором этапе для усиления морфогенеза обычно добавляют цитокинины. Напротив, на третьем этапе при укоренении в питательной среде должно быть только небольшое количество ауксинов (либо используется безгормональная среда). Иногда в среду добавляют гиббереллин (ГК), который стимули­рует рост сформировавшихся почек. Важным регуляторным фак­тором служит сахароза. Обычная концентрация ее в среде состав­ляет 3 %. На растениях каперса было показано, что более высокая концентрация сахарозы в среде приводила к образованию пур­пурных, содержащих антоциан, почек возобновления. При кон­центрациях сахарозы менее 3 % наблюдалось формирование зеле­ных почек, способных к размножению.

Кроме того, существенное значение имеет состояние среды. Например, культивирование меристем земляники, вишни, чер­ной смородины лучше происходит в жидкой питательной среде, чем в агаризованной.

Состояние экспланта. Морфогенез в значительной мере опре­деляется возрастом и размером экспланта. Так, у эхеверии эксп­лантат из молодых листьев образуют корни, из старых листьев — побеги. И только у листьев среднего возраста возникают и побеги, и корни, т.е. появляется возможность регенерации целого расте­ния. Размер экспланта прямо пропорционально связан с регенера- ционной способностью: чем крупнее эксплант, тем выше эта спо­собность. Большие экспланты могут самопроизвольно независимо от соотношения в питательной среде ауксинов и цитокининов об­разовывать почки. Но увеличение размера может привести к нега­тивным последствиям, так как появляется вероятность присутствия в экспланте клеток, содержащих вирусную, грибковую и другие виды инфекции. Оптимальная величина экспланта должна обеспе­чивать как активный морфогенез, так и полную стерильность.

На регенерационную способность экспланта влияют также физиологическое состояние и таксономическая принадлежность растения-донора. Например, экспланты, выделенные из растений в фазу покоя, обладают более низкой способностью к укорене­нию и развитию побегов по сравнению с эксплантами, изолиро­ванными в фазу активного роста. Двудольные травянистые расте­ния характеризуются большей регенерационной способностью, чем однодольные.

Чем больше размер экспланта, тем легче идет морфогенез, в ре­зультате которого получается целое растение, но тем больше ве­роятность присутствия вирусов в экспланте. У многих видов и сор­тов растений зона, свободная от вирусных частиц, различна. Так, при клонировании апикальной меристемы картофеля размером 0,2 мм (конус нарастания с одним листовым зачатком) 70 % по­лученных растений были свободны от Y-вируса картофеля, но только 10 % — от Х-вируса. В некоторых случаях не удается найти оптимальное соотношение между размером меристематического экспланта и морфогенезом в нем, и при этом избавиться от ви­русной инфекции. Приходится дополнять метод культуры мерис­тем термо- или(и) хемитерапией. Так, предварительная термоте­рапия исходных растений позволяет получать свободные от виру­сов растения-регенеранты из меристемных эксплантов размером от 0,3 мм до 0,8 мм. Вместе с тем этот прием может вызвать отста­вание растений в росте, деформацию органов, увеличение латен­тных (скрытых) инфекций.

Хорошие результаты дает совместное применение метода куль­туры тканей и хемитерапии. При внесении в питательную среду препарата «Вирозол» (1-рибофуранозил-1,2,4-триазолкарбоксамид) количество безвирусных растений увеличивается до 80 — 100%.

В настоящее время для диагностики вирусных растений ис­пользуют иммуноферментную технику, моноклональные анти­тела, метод молекулярной гибридизации меченых фрагментов РНК- и ДНК-вироидов и вирусов с вирусами тестируемого объек­та. Эти методы очень чувствительны, но трудоемки и дорого­стоящи.

После оздоровления с помощью вышеперечисленных техноло­гий нормальные растения-регенеранты размножают обычными методами клонального микроразмножения. Для некоторых расте­ний, например цитрусовых, получить морфогенез из меристем малого размера не удается, поэтому требуется разработка ориги­нальных методов. Лимоны и апельсины оздоровляют и размножа­ют, используя прививки меристем размером 0,14 — 0,18 мм на про­бирочные подвои, полученные из семян. Достоинство такого под­хода состоит и в том, что развивающиеся из меристем побеги не имеют ювенильных признаков, при этом цветение и плодоноше­ние ускоряются.

6.8.4. Криосохранение

Сохранение разнообразия форм жизни — важнейшая проблема, с которой столкнулось современное человечество. Еще Г. Ф. Гаузе доказал, что устойчивость сообщества тем выше, чем больше число составляющих его видов. Следовательно, сохранение биоразнооб­разия — единственный механизм стабильности жизни на Земле.

Кроме того, для обеспечения питанием растущего населения на­шей планеты необходимо выведение новых, более продуктивных сортов сельскохозяйственных растений, а для успешной селек­ции важен постоянный приток генов из новых источников. Тради­ционным источником генетического материала служат дикие виды растений. Однако в связи с расширением городов, сельскохозяй­ственных угодий, вырубкой лесов, ухудшением экологии эти виды постепенно вытесняются, а многие из них находятся на грани вымирания, поэтому их необходимо сохранить.

Существует несколько способов сохранения генофонда выс­ших растений: заповедники, национальные парки, банки семян. В последнее время большое внимание уделяется созданию и разви­тию новых способов: пересадочных коллекций каллусных клеток, депонированию культур клеток и, наконец, криосохранению, т. е. хранению объектов при очень низкой температуре, обычно это температура жидкого азота (-196 °С). Криосохранение имеет су­щественные преимущества по сравнению с остальными методами. При сохранении в глубоко замороженном состоянии полностью прекращается обмен веществ, отсутствуют значительные физико- химические молекулярные изменения не только в клетке, но и в окружающей водной среде. Сохраняется генофонд, а следователь­но, все свойства замороженного объекта. Единственный негатив­ный фактор, которого не удается избежать, — это фоновая иони­зирующая радиация. Однако, по мнению М.Ашвуд-Смита, по­требуется примерно 32 000 лет для накопления 10% летальных хромосомных повреждений. Следовательно, криогенный метод дает возможность неограниченно долго хранить растительный матери­ал без существенных изменений: сохраняются жизнеспособность клеток, их свойства, а также способность к морфогенезу и реге­нерации целых растений.

Сущность метода криосохранения сводится к замораживанию специально подготовленных растительных клеток при использова­нии криопротекторов — веществ, ослабляющих повреждения кле­ток при замораживании и оттаивании. В настоящее время известны * два метода криосохранения: программное (медленное) и сверхбы­строе замораживание. Программное замораживание изучалось уже : давно, поэтому оно довольно широко применяется для сохранения животных и растительных клеток. Разработка сверхбыстрого замо-^ раживания началась сравнительно недавно, однако считается, что | именно этот метод со временем станет наиболее перспективным. |

Трудности криосохранения растений связаны со спецификой 1 растительных клеток. Клетки растений имеют большие размеры! (в культуре тканей они изменяются от 15 до 1000 мкм), прочную! целлюлозную стенку и вакуоли. Причем именно степень вакуоли-! зации играет основную роль в устойчивости клеток к действию! низких температур. В зрелой клетке центральная вакуоль занимает!

до 90 % общего объема клетки, т. е. клетка представляет собой как бы резервуар с водой, которая необходима для ее нормальной жизнедеятельности. Поэтому основные факторы, способные при­вести клетку к гибели при замораживании, — это образование льда и дегидратация. Обычно кристаллы льда сначала образуются во внешнем растворе вокруг клеток. Максимальная скорость их роста в зависимости от состава раствора находится в пределах тем­ператур от -20 до -60 "С. При температуре -140 °С рост кристал­лов льда совершенно прекращается. Следовательно, и при замо­раживании, и при оттаивании клеткам очень важно с оптималь­ной скоростью «проскочить» температуру образования льда. Кри­сталлы внеклеточного льда могут механически разрушать клетки. Кроме того, они играют водоотнимающую роль, что приводит к значительной дегидратации клетки и возможной ее гибели от ос­мотического стресса. При очень быстром замораживании лед мо­жет образовываться и внутри клеток, что ведет к разрушению в ней многочисленных мембран.

Избежать кристаллизации льда помогла бы витрификация воды, т. е. затвердение ее в аморфном состоянии. Получить витрифика- цию чистой воды практически невозможно. Но в коллоидных ра­створах скорость образования центров кристаллизации и роста кристаллов льда снижается и повышается температура, при кото­рой их рост прекращается. Все это облегчает витрификацию. До­бавление криопротекторов также затрудняет кристаллизацию льда и способствует витрификации.