БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ 11 страница

2. Культуру протопластов на начальной стадии ее роста зараж! ют агробактериями, которые используют в качестве векторов.

3. Микроинъекции ДНК. Аналогичен методу микроинъекщ животных клеток. Этот метод можно рассматривать как наибол универсальный. Эффективность трансформации растительных клй ток — 10 — 20% независимо от типа вектора. Трансформация не видоспецифична, возможен перенос генов в любое растение.

4. Электропорация. Метод основан на повышении проницаемо­сти биомембран за счет действия импульсов высокого напряже­ния. В результате молекулы ДНК проникают в клетки через поры в клеточной мембране.

5. Упаковка в липосомы. Это один из методов, позволяющих защитить экзогенный генетический материал от разрушения нук- леазами растительной клетки. Липосомы — сферические тельца, оболочки которых образованы фосфолипидами.

Метод биологической баллистики. Это один из самых эффектив­ных методов трансформации однодольных растений. Исходный мате­риал для трансформации — суспензионная культура, каллусная ткань или 4—5-дневные культивируемые незрелые зародыши однодольных.

Метод основан на напылении ДНК-вектора на мельчайшие ча­стички вольфрама, которыми затем бомбардируют клетки. Бом­бардировка осуществляется с помощью биолистической пушки за счет перепада давления. Часть клеток гибнет, а выжившие клетки трансформируются, затем их культивируют и используют для ре­генерации растений.

5.10.2. Применение методов генетической инженерии для улучшения аминокислотного состава запасных белков растений

Решение проблемы создания новых форм растений подразуме­вает в первую очередь повышение качества синтезируемых расте­нием продуктов, которые определяют его питательную и техни­ческую ценность. В основном это касается запасных белков.

В большинстве случаев запасные белки растений имеют несба­лансированный для питания человека и животных аминокислот­ный состав. Так, запасные белки злаков — проламины — бедны лизином, триптофаном и треонином, что снижает их питатель­ную и кормовую ценность. Улучшение аминокислотного состава белка путем традиционной селекции не дает желательных резуль­татов, поскольку необходимые гены часто сцеплены с нежела­тельными признаками и наследуются вместе. Например, у мутан­тов кукурузы и ячменя повышение содержания лизина коррели­ровало с уменьшением синтеза основных запасных белков — зеи- на и гордеина, а также с уменьшением урожайности.

Генно-инженерные методы более перспективны для создания улучшенных сортов, так как позволяют избирательно вводить в геном растения-реципиента гены искомого признака. Операции по получению трансгенных растений с улучшенным аминокислотным составом белка разделены на ряд этапов: 1) клонирование генов запасных белков; 2) изучение механизмов тканеспецифичной и временной экспрессии белков и выявление последовательностей

ДНК, определяющих данный механизм; 3) целенаправленное из­менение последовательностей генов запасных белков для улучше­ния аминокислотного состава; 4) создание векторов, содержащих измененный ген; 5) введение модифицированных генов в растения.

В настоящее время клонированы 10 генов гордеинов ячменя, гены а- и р-глиадинов и глютенина пшеницы, зеинов кукурузы, легумина бобовых, пататина картофеля и ряд других. Имеются практические результаты трансформации растений. Так, введение в геном пшеницы модифицированного гена проламина привело к активному синтезу модифицированного белка, а также повлияло на состав и уровень соответствующих запасных белков. В итоге улуч­шилось хлебопекарное качество пшеничной муки.

5.10.3. Повышение эффективности процесса фотосинтеза

Один из возможных способов увеличения фотосинтеза и, следо­вательно, продуктивности растений состоит в клонировании хлоро- пластных генов в клетках бактерий и их переносе в растения. Изве­стно, что хлоропласты и прокариотические клетки сходны по ряду признаков. На основании этого возникла симбиотическая гипоте­за происхождения хлоропластов, впервые выдвинутая А. С. Фамин- циным (1886). Согласно этой гипотезе, клетки прокариот и хло­ропласты сходны. В них присутствуют кольцевые ДНК, 70S-pn6o- сомы; синтез белков начинается с одной и той же аминокислоты — N-формилметионина, а синтез белка подавляется хлорамфенико- лом, а не циклогексимидом, как у эукариот. Позже было показа­но, что ДНК-зависимая РНК-полимераза Е. coli связывается с определенными участками ДНК хлоропластов шпината.

В клетках Е. coli инициация белкового синтеза частично регу­лируется доступностью участка связывания рибосом (УСР). Его структура до конца еще не выяснена, но расшифрован участок, известный под названием «последовательность Шайн-Дальгарноя (ШД). Она комплементарна З'-концу 168-рибосомальной РНК, и! инициация белкового синтеза начинается с образования компле­ментарной пары между этой последовательностью и З'-концом 16S- рибосомальной РНК. Анализ последовательности ДНК хлороплас-i тного гена большой субъединицы основного фермента фотосин-j теза — рибулозодифосфаткарбоксилазы (РДФкарбоксилазы) куп курузы — выявил значительные гомологии с известными промотор рами и последовательностями ШД клеток Е. coli. Все это привело^ к попытке клонирования генов хлоропластов в клетках Е. coli, наш; более часто используемой в генно-инженерных исследованиях, ч

Транскрипционные конструкции могут создаваться двумя nyi тями: во-первых, это установка промотора рядом с УСР, котой рый узнается полимеразой Е. coli, во-вторых, это формирований гибридного УСР, состоящего из прокариотической последователь!

ности ШД и эукариотического или синтетического инициирую­щего кодона. Первый путь широко применяется для увеличения экспрессии генов Е. coli и хлоропластных генов в клетках Е. coli.

В настоящее время уже клонировано несколько хлоропластных генов: гены синтеза субъединиц РДФкарбоксилазы, белка хлоро­филл-белкового комплекса, АТФсинтетазы, цитохрома и др.

5.10.4. Генно-инженерные подходы к решению проблемы усвоения азота

Азот — один из самых необходимых элементов для растений. Его недостаток в почве или питательном субстрате часто приводит ра­стение к гибели, поэтому в первую очередь необходимо внесение в почву азотных удобрений. Однако их производство требует очень больших энергетических затрат, поэтому оно дорогостояще. Сто­имость азотных удобрений в 6 раз выше стоимости фосфорных удоб­рений и в 16 раз выше стоимости калийных удобрений. При этом растения используют только от 30 до 70 % внесенных в почву до­ступных форм азота, остальное просто вымывается из почвы, за­грязняя окружающую среду. Гораздо более естественно и доступно снабжение растений азотом путем его биологической фиксации.

Фиксация атмосферного азота (диазотрофность) — свойство прокариотических организмов. Азотфиксирующие организмы де­лятся на симбиотические (90 %) и свободноживущие (10 %). Фик­сация атмосферного азота связана преимущественно с симбиоти- ческими микроорганизмами. В настоящее время известны четыре основные системы симбиоза, имеющие большое значение не толь­ко для естественных сообществ, но и для сельского хозяйства, лесоводства. Это Rhizobia — бобовые растения, Azolla-Anabaena — рис, Actinomyces — деревья, Spirillum — травы. Атмосферный азот фиксируется благодаря уникальному ферменту — нитрогеназе.

В 1960 г. американские исследователи показали, что нитрогена- за сохраняет свою активность в бесклеточных экстрактах Clostridium pasteurianum. Это послужило толчком для начала активных иссле­дований биохимии азотфиксации, структуры и механизма дей­ствия нитрогеназы. К 1981 г. нитрогеназа была выделена из 36 ви­дов микроорганизмов. Она считается одним из наиболее сложных ферментов, использующих простые субстраты. Кроме азота нит­рогеназа может восстанавливать ацетилен, цианистый водород, закись азота и некоторые другие соединения. Восстановление аце­тилена в этилен позволило разработать надежный тест для обна­ружения азотфиксирующей активности. Непременное условие ра­боты нитрогеназы — ее защита от кислорода, который ингибиру- ет не только активность нитрогеназы, но и ее биосинтез.

Начиная с 1970 г. стали появляться серьезные работы по изуче­нию генов азотфиксации и их переносу в клетки Klebsiella pneumoniae

qbalfmvsuxneykdh j ш m шл ш mm м н м ■ шш □□□□ ■■ sua

24 • Ю³ пар нуклеотидов

Рис. 5.18. Генетическая карта области «//-генов хромосомы Klebsiella pneumoniae (по А. Сассон, 1987). Оперон HDKY кодирует белки нитроге­назы; стрелки обозначают направление транскрипции

и Е. coli. С помощью техники рекомбинантных ДНК были состав­лены генетические карты генов азотфиксации («//-генов), кото­рые показали сходную организацию генов у большей части азот- фиксирующих организмов. Было установлено, что «//"-гены распо­ложены между генами, кодирующими биосинтез гистидина (his) и генами, ответственными за усвоение шикимовой кислоты (shiA). Гены, кодирующие синтез белковых субъединиц компонентов нит­рогеназы, образуют единый оперон (рис. 5.18). В клетках симбиоти- ческих бактерий Rhizobium leguminosarum, R. meliloti, R. trifolii плаз­миды, кроме структурных генов нитрогеназы, содержат гены, отве­чающие за развитие корневых клубеньков у определенных видов бобовых.

Конструирование плазмид, несущих «//-гены, позволяет переда­вать способность к фиксации азота организмам, не обладающим этим свойством. Среди бактерий, кроме Е. coli, такой перенос осуществлен для бактерий Salmonella typhimurium, Erwinia herbicola и других. Однако подобные манипуляции могут приводить к не­желательным эффектам. Так, перенос генов в штамм Erwinia (бак­терии, вызывающие гниение растений) может усилить его пато­генное действие. Кроме того, существует вероятность случайного переноса вместе с «//-генами каких-то нежелательных генов.

В настоящее время внимание ученых привлекают проблемы вве­дения генов азотфиксации в клетки растений; создания ризоцено-, зов между небобовыми растениями (особенно злаками) и азотфик- сирующими организмами; повышения мощности корневой систе­мы бобовых растений для увеличения на ней количества клубень-: ков. Кроме того, предполагается создание новых азотфиксирующих систем путем введения азотфиксирующих микроорганизмов в кал-; лусные ткани растений с последущим образованием из них расте-i ний-регенерантов, а также повышение эффективности фиксаций; азота путем воздействия на гены, контролирующие этот процесс, i

Наиболее интересна первая проблема — введение «//-генов ri клетки растений. Однако ее решение сопряжено с рядом трудно^ стей. Основная — разрушение нитрогеназы под воздействием киЫ лорода. У азотфиксирующих микроорганизмов существует ряд при-* способлений, защищающих бактерии от свободного кислорода

Среди них присутствие в клетках клубеньков легоглобина — гем- содержащего белка, который встраивается в мембрану бактероида (увеличенная в размере бактериальная клетка, характеризующая­ся наибольшей способностью к фиксации азота) и регулирует по­ступление кислорода. Легоглобин кодируется в геноме раститель­ной клетки-хозяина, но его синтез начинается только после про­никновения бактерий в эту клетку. У цианобактерий механизм за­щиты нитрогеназы от кислорода иной. Азотфиксация идет в гете- роцистах, а фотосинтез — в обычных клетках. Поэтому кислород, выделяющийся в процессе фотосинтеза, не ингибирует фиксацию азота. Таким образом, введение только nif-генов в какую-то расти­тельную клетку не решает проблемы. Если нитрогеназа будет син­тезироваться в этой клетке, в частности в клетках злаков, то она разрушится под действием кислорода, присутствующего в клетке. Кроме того, сама клетка, в которую переносят гены азотфикса- ции, может быть не приспособлена к синтезу и расходованию боль­шого количества энергии, которое требуется для фиксации азота.

Таким образом, более перспективно повышение эффективно­сти фиксации азота в уже существующих природных системах за счет воздействия на гены, контролирующие этот процесс, а так­же увеличение мощности корневой системы бобовых растений и создание новых азотфиксирующих систем с помощью методов кле­точной инженерии.

5.10.5. Устойчивость растений к фитопатогенам

Наибольший урон растениям наносят грибные, бактериальные и вирусные патогены. В растении существуют защитные механиз­мы, которые в большей или меньшей степени (в зависимости от устойчивости растений) начинают действовать в ответ на про­никновение фитопатогенов в клетку. Во-первых, начинается син­тез соединений, вызывающих гибель патогенов. Примером могут служить специфические белки PRP (pathogen related proteins). Из них наиболее изучены ферменты хитиназы и |3-1,3-глюконазы, которые угнетают рост грибов и некоторых видов бактерий, раз­рушая их клеточные стенки. Во-вторых, могут создаваться струк­турные барьеры, препятствующие распространению инфекции. Это достигается благодаря лигнификации клеточных стенок. Той же цели — защите клеток — служит присутствие в клеточных стенках белков-экстенсинов и олигосахаридов.

Применение методов генетической инженерии, использующих естественные защитные механизмы, позволяет получать трансген­ные растения, устойчивые к грибной, бактериальной и вирусной инфекции. Так, гены хитиназы и глюконазы кодируются одиноч­ными генами. Благодаря этому были получены трансгенные рас­тения табака и турнепса, в состав генома которых ввели ген хити- назы. Лабораторные и полевые испытания выявили большую ус­тойчивость трансгенных растений. В растения томатов был введеь ген защитных пептидов редьки (дефензинов) rs, отвечающих зг. устойчивость к фитопатогенным грибам. Наконец, перспективны клонирование и перенос генов, кодирующих специфические бел­ки (small antibiotic-like proteins), содержащиеся в семенах многи:. растений. Эти белки защищают семена в период покоя и во время прорастания от грибных и бактериальных инфекций.

Другой подход к получению трансгенных растений, устойчи­вых к вирусной инфекции, состоит во введении в геном исходны:, растений гена оболочки вируса. Это приводит к ингибированик размножения вируса и снижению инфицированности. Благодаря такому подходу был получен стойкий антивирусный эффект у ра­стений табака, трансформированных геном оболочки вируса та бачной мозаики (ВТМ).

Еще одна группа методов получения трансгенных растений устойчивых к действию фитовирусов, включает введение и эксп­рессию генов антивирусных антител, вирусных сателлитных PHL. Интересный эффект дало введение в геном растений гена челове­ческого интерферона JFN — одного из ключевых белков индук­ции иммунитета у млекопитающих. С помощью вируса мозаики цветной капусты геном интерферона были трансформированы ра стения турнепса, табака, картофеля, что повысило устойчивость этих растений к вирусным заболеваниям. Однако в настоящее вре­мя более перспективными считаются методы, основанные на ис­пользовании растительных генов, обусловливающих высокую ус­тойчивость трансформации растений и низкую устойчивость к фи- топатогенам.

5.10.6. Устойчивость растений к гербицидам

В настоящее время в сельском хозяйстве широко использую- гербициды — химические соединения, применяемые для уничто жения сорной растительности. Гербициды широкого спектра дей, ствия могут не только уничтожать сорняки, но и угнетать рос культурных растений. В связи с этим возникает необходимость создании растений, устойчивых к этим веществам. Существует да подхода к решению этой проблемы: прямая селекция устойчивы^- к гербицидам мутантных форм растений, или мутантных клетоЧ| ных штаммов (клеточная селекция), и генно-инженерный метод который состоит во введении в растения генов гербицид-резиС тентности растительного или бактериального происхождения. i

Изучение механизмов устойчивости служит основой для а здания трансгенных растений. Оно включает четыре основных этап выявление мишеней действия гербицидов в клетке растений; й бор растений, устойчивых к данному гербициду в качестве истой

154 1 ника генов резистентности; идентификация и клонирование этих генов; изучение их экспрессии для использования в трансгенных конструкциях.

Благодаря использованию методов генетической инженерии были созданы новые, устойчивые к различным гербицидам сельскохо­зяйственные культуры. В геном этих культур вводились мутантные гены, кодирующие синтез ферментов, на которые гербициды (ат- разин, бромоксилин, имидазол) не оказывают негативного дей­ствия. Например, растения лядвенца рогатого (Lotus corniculatus) были трансформированы с помощью штамма А281/рСВЕ21. Эта бактерия содержит плазмиду со встроенным геном bar, кодирую­щим фермент, придающий устойчивость к гербициду биалофосу. Трансгенные растения содержали ген bar и были невосприимчи­вы к гербициду (А. М. Стефанович, Г. Н. Ралдугина, 1999). Однако в тканях таких растений наблюдается накопление гербицидов, и использовать эти растения можно только в технических целях. Вме­сте с тем было показано, что введение генов, кодирующих другие ферменты, позволяет проводить детоксикацию гербицидов, со­здавая, таким образом, растения, пригодные в пищу. Так, деток- сикация действующего, вещества гербицида 2,4-D осуществляется при переносе в растение гена монооксигеназы, глифосата — при введении гена фосфонатазы, бромоксилина — гена нитрилазы.

5.10.7. Устойчивость растений к насекомым

Создание трансгенных растений, устойчивых к насекомым, с помощью методов генной инженерии стало возможным после того, как было обнаружено, что бактерии Bacillus thurengiensis синтези­руют специфический белок — прототоксин, высокотоксичный для насекомых. Попадая в кишечник насекомого, этот белок расщеп­ляется, образуя активную форму токсина. В результате насекомое погибает. Ген, ответственный за экспрессию прототоксина, уда­лось обнаружить, выделить из генома В. thurengiensis и с помощью бинарного вектора ввести в геном растений табака. Аналогичным образом растения томата были трансформированы генами друго­го инсектицидного белка — эндотоксина. В итоге были получены первые трансгенные растения, которые не повреждали насекомые.

5.10.8. Устойчивость растений к абиотическим стрессам

Адаптация растений в природе и, следовательно, их способ­ность к выживанию при неблагоприятных условиях среды обеспе­чиваются тремя способами. Во-первых, с помощью физиологи­ческих механизмов, позволяющих растениям избежать неблаго­приятных воздействий (например, период покоя). Во-вторых, адап­тация осуществляется благодаря морфологическим приспособле­ниям: толстому слою кутикулы на листьях, уменьшению листо­вой поверхности, ее опушению, которые предотвращают излищ нюю потерю влаги растениями. В-третьих, негативное влияние внешней среды может быть преодолено с помощью изменений метаболизма. Именно этот последний адаптационный механизь наиболее доступен для генно-инженерных исследований. Напри­мер, известно, что при водном стрессе у высших растений осноь- ным защитным механизмом, связанным с изменением метабо­лизма, является накопление в клетках пролина, глицинбеатина и других осмопротекторов.

Экспериментально было показано, что стрессовый ответ у бак­терий и высших растений выражается сходно. И у растений, и v бактерий начинается усиленный синтез молекул осмопротекто­ров, механизм действия которых состоит в установлении осмотк ческого баланса между цитоплазмой и окружающей средой, а также стабилизации белковых молекул. В бактериях биоситнез пролинь хорошо изучен, известны гены, кодирующие ферменты этогь процесса. Избирательная экспрессия генов осмопротекторов мо« жет привести к увеличению адаптационных качеств растения и следовательно, к увеличению его продуктивности. Поэтому следуй* щим шагом на пути создания устойчивых к стрессам растени было клонирование бактериальных генов, получение векторныЦ конструкций на основе Ti-плазмиды и введение их в растени. Полученные трансгены синтезировали и накапливали пролин 4—6 раз интенсивнее, чем обычные растения. Трансгенные побё ги могли укореняться и расти при концентрации соли в срег 20 г/л (350 мМ).

У растений адаптация к низким температурам сопряжена с мн начисленными физиологическими изменениями. При этом накаг ливаются растворимые вещества, понижающие осмотический пс тенциал клеток и уменьшающие вероятность образования кру, ных кристаллов льда. Кроме того, синтезируется большое кол чество белков с повышенным содержанием сульфгидрильных груг (-SH), которые обладают особо высокой способностью к гидрат ции, а гидратационная вода, как известно, практически не с мерзает. Однако повышение устойчивости растений к замерзаш с помощью методов генной инженерии началось с изменения гей ма не растений, а бактерий. Исследователи Колорадского униве? ситета (США) выяснили, что повреждению растений при замер? нии способствуют бактерии эпифитной (поверхностной) мик$| флоры Pseudomonas syringae и Erwinia herbicola, белки которых ci жат центрами кристаллизации. Если обезвредить бактерии стреп мицином, то растения не замерзают при температуре - 8 °С. Но стр томицин дорог и вреден, поэтому выгоднее было изменить ге тику данного штамма бактерий, вырезав из генома определен! ген. Растения, инфицированные мутантным штаммом P. syrin,:

росли при отрицательной температуре. Однако оказалось, что бак­терии мутантного штамма более живучи и способны вытеснить природный штамм, который, попадая в верхние слои атмосфе­ры, способствует кристаллизации атмосферной влаги. Вероятно, уничтожение природного штамма могло бы привести к экологи­ческой катастрофе.

Следует отметить, что работы по генной инженерии, возмож­ности манипулирования генами растений представляют огромный интерес для фундаментальных исследований. Эти работы позво­ляют изучать основы молекулярной и клеточной биологии расти­тельной клетки, глубинные механизмы процессов, происходящих в ней. Вместе с тем нельзя не задуматься о своевременности при­кладного применения результатов генно-инженерных исследова­ний.

Глава 6

ОСНОВЫ КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ РАСТЕНИЙ

6.1. КУЛЬТУРА КЛЕТОК И ТКАНЕЙ, КРАТКАЯ ИСТОРИЯ

ПРЕДМЕТА

Клеточная инженерия — одно из наиболее важных направле­ний в биотехнологии. Она основана на использовании принципи­ально нового объекта — изолированной культуры клеток или тка­ней эукариотических организмов, а также на тотипотентности — уникальном свойстве растительных клеток. Применение этого объекта раскрыло большие возможности в решении глобальных теоретических и практических задач. В области фундаментальных наук стало осуществимым исследование таких сложных проблем, как взаимодействие клеток в тканях, клеточная дифференциров- ка, морфогенез, реализация тотипотентности клеток, механизмы появления раковых клеток и др. При решении практических задач основное внимание уделяется вопросам селекции, получения зна­чительных количеств биологически ценных метаболитов расти­тельного происхождения, в частности более дешевых лекарств, а также выращивания оздоровленных безвирусных растений, их клонального размножения и др.

Бурное развитие клеточной инженерии приходится на 50-е годы прошлого века, хотя первые попытки выращивания изолированных кусочков ткани были сделаны гораздо раньше. В конце XIX — начале XX в. немецкие ученые X. Фехтинг (1892), С. Рехингер (1893), Дж. Ха- берландт (1902) сделали первую неудачную попытку стимуляции роста растительных тканей и органов, помещенных на фильтро­вальную бумагу, пропитанную сахарозой. Несмотря на отсутствие положительного результата, их работы представляют большой инте­рес. В них были высказаны идеи, которые намного опередили раз­витие науки того времени и которые нашли свое подтверждение несколько десятилетий спустя. Так, Фехтинг предположил, что полярность присуща не только организму или органу растения, но и самой клетке. Рехингер определил минимальный размер сег­мента, образующего каллус. Согласно его исследованиям, в кусоч­ках ткани тоньше 1,5—2,0 мм клетки не делились. Хаберландг впер­вые четко сформулировал идеи о возможности культивирования in vitro изолированных клеток растений и о тотипотентности кле­ток, т. е. способности любой соматической клетки полностью реа- лизовывать свой потенциал развития. Иначе говоря, о способнос­ти каждой растительной клетки давать начало целому организму.

Первые успехи были получены в 1922 г. американским ученым В. Роббинсом и немецким ученым В. Котте. Независимо друг от друга они показали возможность выращивания меристем кончи­ков корней томатов и кукурузы на синтетической питательной среде. Считается, что их работы легли в основу метода культуры изолированных корней растения.

Настоящее развитие метода культуры тканей и клеток высших растений началось в 1932 г. с работ французского ученого Р. Готре и американского исследователя Ф.Уайта. Они показали, что при периодической пересадке на свежую питательную среду кончики корней могут расти неограниченно долго. Кроме того, ими были разработаны методы культивирования новых объектов: тканей древесных растений камбиального происхождения, каллусных тканей запасающей паренхимы (Р. Готре), а также тканей расти­тельных опухолей (Ф.Уайт). С этого момента начинаются массо­вые исследования по разработке новых питательных сред, вклю­чающих даже такие неконтролируемые компоненты, как березо­вый сок или эндосперм кокоса, и по введению в культуру новых объектов. К 1959 г. насчитывалось уже 142 вида высших растений, выращиваемых в стерильной культуре.

В 1955 г. после открытия Ф. Скугом и С. Миллером нового клас­са фитогормонов — цитокининов — оказалось, что при совмест­ном их действии с другим классом фитогормонов — ауксинами — появилась возможность стимулировать деление клеток, поддер­живать рост каллусной ткани, индуцировать морфогенез в конт­ролируемых условиях.

В 1959 г. был предложен метод выращивания больших масс кле­точных суспензий. Важным событием стала разработка Е. Коккин- гом (Ноттингемский университет, Великобритания) в 1960 г. ме­тода получения изолированных протопластов. Это послужило тол­чком к получению соматических гибридов, введению в протопла­сты вирусных РНК, клеточных органелл, клеток прокариот. В это же время Дж. Морелом и Р. Г. Бутенко был предложен метод кло- нального микроразмножения, который сразу же нашел широкое практическое применение. Весьма важным достижением в разви­тии технологий культивирования изолированных тканей и клеток стало культивирование одиночной клетки с помощью ткани-«нянь- ки». Этот метод был разработан в России в 1969 г. в Институте физиологии растений им. К. А.Тимирязева РАН под руководством Р. Г. Бутенко. В последние десятилетия продолжается быстрый про­гресс технологий клеточной инженерии, позволяющих значительно облегчить селекционную работу. Большие успехи достигнуты в раз­витии методов получения трансгенных растений, технологий ис­пользования изолированных тканей и клеток травянистых расте­ний, начато культивирование тканей древесных растений.

6.2. МЕТОДЫ И УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

ИЗОЛИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ И КЛЕТОК РАСТЕНИЙ

Выращивание изолированных клеток и тканей на искусствен­ных питательных средах в стерильных условиях (in vitro) получи­ло название метода культуры изолированных тканей.

В связи с тем что в жизни человека наибольшее значение име­ют семенные растения, методы и условия для их культивирова­ния разработаны лучше, чем для голосеменных растений или во­дорослей, выращивание которых в стерильных условиях вызывает определенные затруднения. Однако независимо от принадлежнос­ти растений к той или иной таксономической группе существуют общие требования к выращиванию объектов в культуре in vitro.

Асептика. Прежде всего культивирование фрагментов ткани или органа растения — эксплантов, а тем более отдельных клеток тре­бует соблюдения полной асептики. Микроорганизмы, которые мо­гут попасть в питательную среду, выделяют токсины, ингибирую- щие рост клеток и приводящие культуру к гибели. Поэтому при всех манипуляциях с клетками и тканями при культивировании in vitro соблюдают определенные правила асептики в ламинар- боксе или в асептических комнатах. В первом случае асептика дос­тигается подачей профильтрованного стерильного воздуха, направ­ленного из ламинкар-бокса наружу, на работающего. Асептичес­кие комнаты стерилизуют с помощью ультрафиолетовых ламп, а работают в таких помещениях в стерильной одежде. Рабочую по­верхность столов в асептических комнатах и инструменты перед работой дополнительно стерилизуют спиртом.

Чистую посуду, предварительно завернутую в бумагу или в фоль­гу, инструменты, бумагу, вату стерилизуют сухим жаром в сушиль­ном шкафу при температуре 160 °С в течение 1,5 —2 ч. Питательные среды стерилизуют в автоклаве при температуре 120 °С и повышен­ном давлении в течение 15 — 20 мин. Если в состав питательных сред входят вещества, разрушающиеся при автоклавировании, их сле­дует стерилизовать путем фильтрации через бактериальный фильтр. Затем стерильные профильтрованные компоненты добавляют в проавтоклавированную среду, охлажденную до температуры 40 °С.

Растительные ткани сами по себе могут служить серьезным источ­ником заражения, так как на их поверхности всегда находится эпи- фитная микрофлора. Поэтому необходима поверхностная стерили­зация, которую проводят следующим образом. Предварительно часть растения, из которой будет извлечен эксплант, промывают водой с мылом и споласкивают чистой водой. Затем растительный материал стерилизуют в растворах дезинфицирующих веществ. Некоторые из этих веществ, а также время стерилизации представлены в табл. 6.1.