БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ 10 страница

/ ГТАЦАТАЦЦАЦЦГАААГАЦАТ [ГЦТАГ, .

«липкий» конец BamHI

•он >

\ Ч

Рекомбинантная плазмида

1. Транс­формация в E.coli

2. Синтез белка in vivo

Фрагмент

^H2N р^галаето"- Мет-ТирТлиТли-Фен-Лей(ОН) зидазы

Гибридный белок

/ Расщепление У BrCN in vitro

Фрагменты Активный лейцин-энкефалин р-галактозидазы

Рис. 5.12. Схема синтеза гибридного и активного лейцин-энкефалина

<4 li.

i f

83-

X ж и—о I

я

а также к сегменту лактозного оперона (lac) из генома Е. coli или к (3-галактозидазному гену. Такую синтетическую чужеродную ДНК встраивали непосредственно за бактериальным геномом (или внут­ри его) после расщепления ДНК рестрикционными эндонуклеаза- ми с образованием в результате трансляции гибридного белка.

Основные этапы генно-инженерного синтеза соматостатина по­казаны на рис. 5.14. Синтетический ген соматостатина был встроен в плазмиду pBR322 Е. coli вблизи конца гена, кодирующего фер­мент (3-галактозидазу. Между двумя генами был помещен кодон метионина. После выделения рекомбинантной плазмиды в бакте­риальную клетку кишечная палочка стала синтезировать гибрид-

in VIVO

ДНК-плазмида pBR 322

г^г^г^г^г^г^гл

Рис. 5.14. Схема синтеза соматостатина в бактериальной системе

ный белок. Часть его (соматостатин) затем отщепляли от Р-галак-? тозидазы BrCN. Такой сложный способ получения гормона был необходим, так как соматостатин, синтезированный в виде свобод­ных молекул, быстро деградирует под действием бактериальных протеаз. Первый синтез соматостатина генно-инженерным спосо­бом был осуществлен в 1977 г. Бойером. Выход гормона составил 10000 молекул на одну клетку. Из 100 г биомассы Е. coli, выра­щенной в ферментере объемом 8 л, удалось выделить 5 мг сомато­статина, т.е. столько, сколько можно его выделить из 100 г овечь­их мозгов.

5.8. СИНТЕЗ СОМАТОТРОПИНА

Соматотропин (или гормон роста человека ГРЧ) секретирует- ся передней долей гипофиза. Впервые он был выделен и очищен в 1963 г. из гипофиза. Его недостаток приводит к заболеванию — гипофизарной карликовости (1 случай на 5000 человек). Гормон обладает видовой специфичностью. Обычно его получают из гипофи­за трупов, но в недостаточном количестве. Гормона хватает лишь для лечения 1/3 случаев гипофизарной карликовости в развитых стра­нах. Основные производители — Швеция, Италия, Швейцария и США. Молекула ГРЧ состоит из 191 аминокислотного остатка.

Препарат из трупного материала представляет собой смесь из нескольких форм, из которых пять имеют 22 кДа, другие являют­ся димерами, а остальные — фрагментами, образующимися при протеолизе. Это приводило к тому, что у 30 % больных, получав­ших препарат, против гормона вырабатывались антитела, сводив­шие на нет его биологическую активность.

Принимая во внимание это обстоятельство, в настоящее время ГРЧ синтезируют методами генетической инженерии в специаль­но сконструированных клетках бактерий. Будучи синтезированным в клетках Е. coli, ГРЧ содержит дополнительный остаток метиони­на на Н₂ТЧ-конце молекулы. Биосинтез ГРЧ из 191 аминокислот­ного остатка был осуществлен в 1979 г. Д. Гедделем с сотрудника­ми. Сначала клонировали двунитевую кДНК; далее путем расщеп­ления получали последовательность, кодирующую аминокислот­ный порядок гормона, за исключением первых 23 аминокислот, — с фен (—NH₂) до лей (23), и синтетический полинуклеотид, со­ответствующий аминокислотам от первой до двадцать третьей со стартовым ATG-кодоном в начале. Затем два фрагмента объеди­няли и подстраивали к паре lac-промоторов и участку связыва-i ния рибосом. Конечный выход гормона составил 2,4 мкг на 1 мл( культуры, что составляет 100 000 молекул гормона на клетку; Полученный гормон на конце полипептидной цепи содержал дополнительный остаток метионина и обладал значительной био­логической активностью. С 1984 г. после серьезных клинических ис­пытаний на токсичность компанией «Генетек» (Сан-Франциско) было начато широкомасштабное производство бактериального со- матотропина.

ГРЧ в клетках Е. coli и в культуре клеток животных был получен в 1982 г. одновременно в Институте Пастера (Париж) и в Институ­те молекулярной биологии (Москва). Оказалось, что в бактериаль­ных клетках возможен синтез аналогов ГРЧ, с помощью которых изучались участки молекулы, важные для стимулирования роста и процесса неоглюкогенеза на молекулярном уровне.

Огромный интерес представляют выделение и синтез поли­пептида, обладающего полной биологической активностью гипо- таламического рилизинг-фактора соматотропина (СТГ-РФ). Вве­дение этого фактора способно компенсировать недостаток сома­тотропина. Таким образом, наличие СТГ-РФ и самого гормона, полученных в генетически сконструированных бактериальных клет­ках, очень важно для успешного лечения заболеваний, обуслов­ленных недостатком этого гормона, и ряда патологических забо­леваний, таких, как некоторые формы диабета, регенерация тка­ней после ожогов и др. Предполагаем, что СТГ-РФ можно ис­пользовать и для увеличения массы и роста домашних животных, так как он, не обладая видовой специфичностью, способен сти­мулировать освобождение гормона роста у ряда животных.

Р-Эндорфин — опиат мозга, состоящий из 31 аминокислотного остатка, был синтезирован в генетически сконструированных клет­ках в 1980 г. группой ученых из Австралии и США. Р-Эндорфин получен в клетках Е. coli в виде гибридного белка с Р-галактози- дазой. Процедура синтеза Р-эндорфина включала: получение пу­тем обратной транскрипции мРНК — кДНК, кодирующей белок- предшественник, содержащий помимо последовательности Р-эн- дорфина последовательность АКТГ и p-липотропина (Р-ЛТГ), в дальнейшем удаляемые. p-Эндорфин, полученный из гибридного белка и тщательно очищенный, обладал значительной биологи­ческой активностью. Он специфически взаимодействовал с анти­сывороткой против Р-эндорфина. От p-эндорфина человека ген­но-инженерный p-эндорфин отличался по двум аминокислотам, и эти отличия можно было легко устранить на нуклеотидном уровне путем замены двух кодонов в ДНК бактериальной плазмиды.

5.9. ПОЛУЧЕНИЕ ИНТЕРФЕРОНОВ

Интерфероны были открыты в 1957 г. в Национальном инсти­туте медицинских исследований в Лондоне как факторы устойчи­вости к вирусной инфекции. Было установлено, что клетки жи­вотных, подвергнутые воздействию вируса, выделяют в среду фак­тор, способный придавать свежим клеткам устойчивость к вирус­ной инфекции: он как бы препятствовал (интерферировал) раз­множению вирусов в клетке и в силу этой способности был на­зван интерфероном.

Известны три группы интерферонов: а-интерфероны (а-И), образующиеся при воздействии вирусов на лейкоциты; Р-интер- фероны (Р-И), появляющиеся при воздействии вирусов на фибро- бласты; у-интерфероны, продуцируемые Т-лимфоцитами в ответ на воздействие бактериальными и вирусными антигенами или ан­тисыворотками против поверхностных детерминант лимфоцитов.

Все интерфероны (кроме а-И) гликопротеины; они представля­ют собой типичные глобулярные белки, причем на долю а-спи- ральных структур приходится от 40 до 75 %. В а-И обнаружены две дисульфидные связи. Интерфероны — низкомолекулярные белки из 146—166 аминокислотных остатков; видоспецифичны.

К числу наиболее хорошо исследованных интерферонов челове­ка следует отнести а-интерфероны; число генов, их кодирующих, примерно 20. у-Интерферон в отличие от гетерогенного класса а- интерферонов представлен всего одним индивидуальным белком, который кодируется одним геном. Менее ясна ситуация в отноше­нии Р-интерферонов. Выделен только один белок, соответствую­щий Р-интерферону человека, — интерферон р,; ему соответствует практически вся противовирусная активность, обнаруживаемая после индукции фибробластов. Не исключено, что в геноме суще­ствует ряд генов, кодирующих различные Р-интерфероны. Интер­фероны — это как бы первая линия обороны против инфекции.

Интерфероны широко используются для лечения различных тяжелых заболеваний — острого вирусного гепатита, рассеянного склероза, остеосаркомы, миеломы и некоторых видов лимфом. Их применяют и для лечения меланом, ряда опухолей гортани, лег­ких и мозга.

С учетом видоспецифичности интерферонов, предназначенных для лечения, необходимы такие препараты, которые получены из клеток человека. Традиционно их извлекают из крови человека (из 1 л крови можно выделить всего 1 мкг интерферона, т. е. пример­но одну дозу для инъекции). Долгое время большая часть мирово­го производства интерферонов осуществлялась в Финляндии (Хель­синки), а позже — во Франции. С 1980 г. одна из японских компа­ний наладила производство лимфобластоидного интерферона из лимфобластоидных клеток. С этой целью культура данных клеток индуцировалась вирусом сендай, после чего интерферон выделя­ли с помощью хроматографических колонок, заполненных моно- клональными антителами против получаемого интерферона. В Шве­ции лимфобласты выращивали в ферментерах объемом 2000 л; полученные интерфероны очищали с помощью моноклональных антител.

Из всех видов интерферонов для мирового производства наи­более пригоден (3-И. Фибробласты, получаемые из тканей плода, можно поддерживать в культуре клеток, что дает возможность массового производства. Метод получения 3-интерферона был разработан в Англии.

В целом вышеперечисленные методы получения интерферонов характеризуются низким выходом, высокой стоимостью и недо­статочной чистотой препарата. На современном этапе наиболее перспективный метод — биосинтез интерферонов с помощью гене­тически сконструированных микроорганизмов. Однако использова­ние генно-инженерных технологий для получения интерферонов человека сопряжено с рядом трудностей. Во-первых, в смеси мРНК, кодирующих различные белки, содержание кодирующих интерферон чрезвычайно мало — всего около 0,1%. Тем не менее кДНК, полученные обратным транскрибированием, были клониро­ваны в Е. coli, что явилось революционным событием в теорети­ческих и прикладных исследованиях интерферонов. Ген интерфе­рона был встроен в векторную ДНК, и к нему были присоедине­ны бактериальные регуляторные элементы, программирующие его транскрипцию и трансляцию в бактериальной клетке (рис. 5.15).

Установлено, что интерфероны синтезируются в клетке снача­ла в виде предшественников, содержащих на N-конце полипеп­тидной цепи сигнальный пептид, который затем отщепляется, и в результате образуется зрелый интерферон, обладающий полной биологической активностью. Бактерии не содержат ферментов,

Точка инициации Рис. 5.15. Схема рекомбинантной плазмиды, обусловливающей синтез интерферона человека в Е. coli

способных отщепить сигнальный пептид с образованием зрелого белка. Поэтому для того чтобы бактерии синтезировали зрелый интерферон, следует ввести в плазмиду только ту часть гена, кото­рая его кодирует, и удалить часть гена, кодирующую сигнальный пептид. Данная процедура осуществлялась следующим образом. Геь интерферона содержит три участка расщепления рестриктазой Sau ЗА1, из которых один находится рядом с сигнальной частью. Не­полное расщепление гена этим ферментом позволяет выделить фрагмент гена, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую зрелый интерферон, но без первого цистеина. Трип­лет ATG, кодирующий цистеин, отщепляется ферментом вместе с сигнальной частью. Для восстановления полинуклеотидной пос­ледовательности полного гена химически был синтезирован не­большой фрагмент ДНК, содержащий данный триплет, а также примыкающий к нему триплет ATG — точка инициации синтеза белка. Этот фрагмент присоединили к изолированной части зре­лого гена, и в результате был восстановлен полный ген зрелого интерферона. Реконструированный ген ввели в плазмиду таким образом, что с ним оказался рядом участок ДНК-промотор, обес» печивающий начало синтеза мРНК. Экстракты из Е. coli, содер­жащие такую плазмиду, обладали противовирусной активностью.

Синтезированный генно-инженерным способом интерферон был выделен, очищен, и его физико-химические свойства оказа­лись близкими свойствам интерферона, полученного из крови, доноров. Удалось получить бактерии, способные синтезировать до 5 мг интерферона на 1 л бактериальной суспензии, содержащей примерно 10^й бактериальных клеток, что в 5000 раз превосходит то количество интерферона, которое можно извлечь из 1 л крови доноров. При использовании генно-инженерных технологий в раз­ных лабораториях были получены штаммы бактерий, продуцирую­щих различные интерфероны: а-, (3- и у-типов. Недостаток исполь­зования Е. coli для получения [3- и у-интерферонов — отсутствие В бактерии аппарата гликозилирования эукариотических белков, что приводит к синтезу негликозилированных молекул. И хотя роль' гликозилирования неясна и негликозилированные р- и у-интер- фероны практически полностью сохраняют противовирусную ак­тивность, эта особенность диктует осторожный подход к исполь­зованию генно-инженерных препаратов в медицинской практике.

В настоящее время гены интерферонов клонированы в дрожжИ| и клетки высших эукариот, способных осуществлять гликозили- рование.

В 1981 г. в США впервые для синтеза лейкоцитарного интерфе-" рона человека были употреблены генетически сконструирован­ные клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Полученная эффек; тивная экспрессия гена LeIF и замена бактерий клетками дрож жей позволили увеличить производство интерферона в 10 раз. >

Большое количество исследований было посвящено химичес­кому синтезу гена, кодирующего ЛИЧ из 166 аминокислот. Соот­ветственно, данный ген из 514 н.п. оказался самым крупным ге­ном, синтезированным в 1982 г. группой английских ученых. В Рос­сии в 1984 г. был осуществлен полный синтез гена а-И размером

Интерферон ♦

Мембранный рецептор

| Мессенджер

эоооооос

Протеинкиназа 1

Клеточный геном

Индукция ^ синтеза ферментов

к», .»•.'» •«., i / Л <V Л- A- At н ч Л' *

Двухцепочечная РНК

Активация РНКазы I, деградация иРНК и рРНК

Рис. 5.16. Механизм действия интерферона

примерно 600 н.п. (Институт биоорганической химии под руксй| водством М. Н. Колосова).

Несмотря на успехи, достигнутые в области получения интерн феронов с помощью генно-инженерных технологий и их приме-*, нения для лечения различных вирусных заболеваний, в том числе? онкологических, предстоит еще решить многие вопросы. На co-f временном этапе не все гены интерферонов идентифицированы: обнаружены новые гены a_L; мало известно о генах фибробластно-; го интерферона (кроме гена Pi); до конца не расшифрованы меха­низмы их биосинтеза и взаимодействия с другими веществами. Вы­яснение многих явлений, связанных с интерферонами, приведет; к созданию новых средств для лечения ряда тяжелых заболеваний.

Схема биологического действия интерферона представлена на рис. 5.16. ;>

Механизм действия интерферона можно свести к следующим? основным этапам. Связываясь с клеточными рецепторами, интер-, фероны инициируют синтез двух ферментов: 2',5'-олигоаденилат- синтетазы и протеинкиназы за счет инициации транскрипции со­ответствующих генов. Оба фермента проявляют свою активность в присутствии двухцепочечных ДНК, являющихся продуктами реп­ликации многих вирусов или содержащихся в их вирионах. Фер~, мент 2',5'-олигоаденилатсинтетаза катализирует синтез 2',5'-олиго-; аденилатов (из АТР), которые активируют клеточную рибонуклеа- зу I; протеинкиназа фосфорилирует (и тем самым активирует) фак­тор инициации трансляции IF₂. В результате этих событий ингиби-> руются биосинтез белка и размножение вируса (деградация иРНК. и рРНК) в инфицированной клетке, что вызывает ее лизис. Веро­ятны и другие механизмы действия интерферонов, например, инактивация тРНК, нарушение процессов метилирования и др. .

5.10. ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ РАСТЕНИЙ

I

Генно-инженерные методы, в частности технология рекомби-* нантных ДНК, позволяют создавать новые генотипы и, следова-, тельно, новые формы растений гораздо быстрее, чем классичес­кие методы селекции. Кроме того, появляется возможность целе-' направленного изменения генотипа — трансформации — благси даря введению определенных генов. '

Проблемы выращивания сельскохозяйственных растений свя­заны с перспективой ввода в них генов устойчивости к стрессо­вым факторам, фитопатогенам, гербицидам и пестицидам, генов скороспелости, а также с расширением круга культурных расте ний, способных к симбиотической фиксации азота и т.д.

Генетическая трансформация заключается главным образом ^ переносе чужеродных или модифицированных генов в эукариоти-
ческие клетки. Можно вводить гены в клетки прокариот, но этот перенос осуществляется не для трансформации, а в целях увеличе­ния экспрессии чужеродных генов, их клонирования. В клетках растений также возможна экспрессия генов, перенесенных не только от других растений, но и от микроорганизмов и даже от животных.

Получение растений с новыми свойствами из трансформиро­ванных клеток (регенерация) возможно благодаря их свойству то- типотентности, т.е. способности развиваться в целое растение.

Однако возможности генной инженерии растений ограничи­ваются рядом причин. Во-первых, геном растений изучен хуже, чем геном млекопитающих. Это значит, что определение и выде­ление искомых генов — задача очень трудная. Во-вторых, не для всех растений удается подобрать условия регенерации. Стабильно получают растения-регенеранты из протопластов картофеля, лю­церны, томатов, моркови, табака, капусты и др. Регенерацию зла­ков из их клеток пока не всегда удается воспроизвести. Наконец, одна из главных лимитирующих причин — размер гетерологичной ДНК (не более 35 кб для агробактериальной и немного больше для баллистической трансформации), которую можно было бы эффективно вводить в геном растения. Не так давно была сделана удачная попытка использовать при трансформации пыльцу в ка­честве супервектора, что позволяет исключить появление химер­ных растений (В. А. Аветисов, Ю. В.Давыдова и др., 1999). Имеют­ся сообщения об использовании искусственной бактериальной хро­мосомы в качестве вектора для трансформации, которая позволя­ет переносить значительные фрагменты ДНК, вводить кассеты ге­нов, кодирующие множественные ступени биохимических про­цессов. Это открывает такие огромные перспективы, что перво­степенными становятся вопросы экологической безопасности.

Биотехнология и, в частности, генная инженерия подошли к той ступени развития, когда прежде всего приходится думать о возможных последствиях эксперимента, об использовании полу­ченных знаний.

5.10.1. Получение трансгенных растений

Перенос генов в растительные клетки, так же как в клетки живот­ных, и их встраивание в геном растений (трансформация) осуще­ствляются главным образом благодаря специфическим структу­рам — векторам.

Векторы на основе Ti-плазмид. Некоторые виды агробактерий (Agrobacteria) могут заражать двудольные растения, вызывая об­разование опухолей — корончатых галлов. Одним из самых силь­ных индукторов опухолей служит почвенная бактерия A. tumefaciens. Способность этой бактерии к образованию опухоли связана с боль­шой внехромосомной плазмидой, получившей название Ti-плаз-

•> п..
мида (от ангд. tumor inducing— индуцирующие опухоль). Ti-плас миды — это естественные векторы для генов, обладающие всем* функциями, необходимыми для переноса, стабильного в ключе ния и экспрессии генетической информации в растениях. Ош_ имеют широкий круг хозяев. В бактериальных клетках Ti-плазми- ды реплицируются автономно. Эти плазмиды различаются по тигг кодируемых опинов — белков, которые используются бактерия­ми в качестве источников азота и углерода. Обычно встречаются плазмиды, кодирующие два типа опинов: либо октопин (октопи новая плазмида), либо нопалин (нопалиновая плазмида).

После заражения часть Ti-плазмиды встречается в хромосома; клеток растения-хозяина. Следовательно, A. tumefaciens встраива­ет часть своего генома в ДНК растительной клетки и заставляет et- таким способом изменять метаболизм, синтезируя вещества, не обходимые для бактерий. Именно это свойство A. tumefaciens i послужило поводом для создания на основе Ti-плазмиды векто­ра, доставляющего необходимые гены в клетку.

Участок Ti-плазмиды, встречающийся в хромосомах раститель­ных клеток, называется Т-областью в бактерии и Т-ДНК в клет­ках растений. Т-область включает примерно 10 % Ti-плазмиды и содержит гены, отвечающие за индукцию опухоли, синтез опи­нов и подавление дифференцировки (гормоннезависимый рост клеток). Важно отметить, что все гены, ответственные за перенос и интеграцию генов Т-области, находятся не в ней самой, а ря­дом — в области вирулентности — vir-области (рис. 5.17).

Т-области ограничены прямыми повторяющимися последова­тельностями, и любая ДНК, вставленная между этими повтора­ми, будет принята за Т-область и перенесена в растительную клетку Недостаток этих плазмид состоит в том, что некоторые гены находящиеся в Т-ДНК, заставляют расти клетки растений незави симо от гормонов, вносимых в питательную среду, на которой куль

тивируются данные клетки. В свя зи с этим очень трудно регене рировать нормальное растение и клеток, содержащих полнук, последовательность Т-ДНК. Др> гой недостаток — большие par меры Ti-плазмиды, из-за коте рых затруднены какие-либо м. нипуляции с ней, поэтому вст вить ген в плазмиду традицио! ными методами невозможно.

В настоящее время констр ируются производные Ti-пла миды, в которых оставляют р гуляторный участок Т-обласг
а вместо ее структурных генов вшивают структурную часть гена, который надо ввести в растение. Такие гены с позиции их регене­рации безвредны для растений.

Существуют и другие бактерии (A. rhizogenes), вызывающие уси­ленное образование корешков при заражении растений. За этот процесс ответственны содержащиеся в них так называемые Ri- плазмиды (от англ. root inducing — индуцирующий корни). Ri-плаз- миды выгодно отличаются от Ti-плазмид тем, что они служат ес­тественными безвредными векторами, так как трансформирован­ные с их помощью растительные клетки сохраняют способность к морфогенезу и к регенерации здоровых растений. В связи с этим Ri-плазмиды в данный момент рассматриваются как более перс­пективные векторы.

Промежуточный и бинарный векторы. Эти векторы конструиру­ются на основе Ti-плазмид. Промежуточный вектор получают пу­тем ряда сложных операций. Сначала Т-область с помощью рест­риктаз вырезают из плазмиды, вставляют в вектор для клониро­вания в клетке Е. coli и размножают. Затем внутрь Т-области встра­ивают чужеродный ген и вновь размножают. Полученную реком- бинантную плазмиду вводят в клетки A. tumefaciens, несущие пол­ную Ti-плазмиду. В результате двойного кроссинговера между го­мологичными участками Т-область рекомбинантной плазмиды, со­держащая чужеродный ген, включается в Ti-плазмиду клетки хозя­ина, заместив в ней нормальную Т-область. Наконец, бактериями, имеющими Ti-плазмиду со встроенными генами, заражают рас­тения, где эти гены встраиваются в геном растительной клетки.

Бинарные векторы представляют собой бактерии, содержащие две разные Ti-плазмиды. Одна из них несет vir-область и обеспе­чивает интеграцию в геном растительной клетки Т-области, со­держащей любые гены другой плазмиды. В этом случае двойной кроссинговер не требуется.

Однако полученные в результате заражения бактериями расти­тельные клетки не способны к регенерации, так как у них подав­лена дифференцировка. Трансформированные растительные клетки смогут дифференцироваться, если в гены, блокирующие диффе- ренцировку, ввести мутации или вырезать их из Т-ДНК.

Векторы на основе ДНК-содержащих вирусов растений. Виру­сы можно рассматривать как разновидности чужеродной нуклеи­новой кислоты, которые реплицируются и экспрессируются в клет­ках растений. Подавляющее большинство фитовирусов в качестве носителя генетической информации содержат РНК. Только 1 — 2 % чирусов, инфицирующих растения, относятся к ДНК-содержа- щим. Именно эти вирусы удобны для использования в технологии Рекомбинантных ДНК, а также в качестве векторов.

ДНК-содержащие вирусы могут включать одноцепочечную или двухцепочечную ДНК. В качестве представителей первой группы можно назвать вирус золотистой мозаики фасоли (ВЗМФ| или вирус полосатости кукурузы. Наиболее изученный представи­тель группы вирусов с двухцепечечной ДНК — вирус мозаики цветной капусты (ВМЦК), поражающий в основном растения' семейства крестоцветные.

Обычно фитовирусы реплицируются с образованием большое го числа копий молекул нуклеиновых кислот — 10⁶ и более моле­кул на зараженную клетку. Например, при репликации вируса та­бачной мозаики образуется 10⁷ молекул нуклеиновых кислот (РНК) на клетку. Поэтому фитовирусы представляют собой очень эффективные средства для получения хорошей экспрессии чуже­родного гена. Кроме высокой копийности вирусной нуклеиновой кислоты вирусные векторные системы имеют еще ряд преиму­ществ: малый размер генома (возможность легкой манипуляций вирусной ДНК) и сильные промоторы, обеспечивающие эффек­тивную экспрессию чужеродных генов.

Однако вирусы в качестве векторов обладают и существенным^ недостатками: имеют небольшую емкость, патогенны и неспособ* ны встраиваться в хромосомы хозяина. Небольшую емкость мож% но увеличить, если инфицировать вирусом (например, ВМЦК| растительные протопласты, а не клетки. В этом случае инфекция не передается от клетки к клетке, нет необходимости в упаковке ДНК в вирусные частицы. ;

Следовательно, часть вирусного генома, ответственная за упа* ковку в вирусные частицы, может быть удалена и замещена до, полнительной чужеродной ДНК. Другой недостаток — отсутствий способности встраиваться в геном растительной клетки — удается обойти (по крайней мере для ВМЦК) благодаря специальном® методическому приему — агроинфекции. Для этого геном ВМЦ1 встраивают в Т-область Ti-плазмиды и в ее составе интегрируют ядерный геном различных растений.

Методы прямого переноса генов в растение. Эти методы возню* ли благодаря появлению специфического объекта — изолирован ных протопластов, т. е. клеток, лишенных целлюлозной стенки. -

Методы прямого переноса генов довольно многочисленны:

1. Трансформация растительных протопластов. Осуществляете благодаря комбинации методик кальциевой преципитации ДЬ и слияния протопластов. Для трансформации может быть испол зован практически любой ДНК-вектор. Донорная ДНК может * содержать специальных биологических сигналов (vir-областей, m граничных областей Т-ДНК).