БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ 7 страница

Ферменты, иммобилизованные путем включения в структур^ липосом, используют преимущественно в медицинских и науч-' ных целях, ибо значительная часть ферментов в клетке локализо­вана в составе липидного матрикса биологических мембран, по-*! этому изучение липосом имеет большое значение для пониманий закономерностей процессов жизнедеятельности в клетке. I

Другие приемы иммобилизации ферментов, основанные физических методах, менее распространены по сравнению с рас-1 смотренными выше. |

Химические методы иммобилизации ферментов. Иммобилиза! ция ферментов путем образования новых ковалентных связей междя ферментом и носителем — наиболее массовый способ получений промышленных биокатализаторов. |

90 |

О + о—о + ^^^

Носитель Вставка Фермент Иммобилизованный

фермент

Рис. 4.5. Схема иммобилизации фермента химическим методом (по Н.В.Березину с сотр., 1987)

В отличие от физических методов этот способ иммобилизации обеспечивает прочную и необратимую связь фермента с носите­лем и часто сопровождается стабилизацией молекулы энзима. Од­нако расположение фермента относительно носителя на расстоя­нии одной ковалентной связи создает стерические трудности в осуществлении каталитического процесса. Фермент отделяют от носителя с помощью вставки (сшивка, спейсер), в роли которой чаще всего выступают бифункциональные и полифункциональ­ные агенты (бромциан, гидразин, сульфурилхлорид, глутаровый диальдегид и др.). Например, для выведения галактозилтрансфе- разы из микроокружения носителя между ним и ферментом встав­ляют последовательность —СН₂—NH—(СН₂)₅—СО—. В этом случае структура иммобилизованного фермента включает носитель, встав­ку и фермент, соединенные между собой ковалентными связями (рис. 4.5).

Принципиально важно, чтобы в иммобилизации фермента уча­ствовали функциональные группы, не существенные для его ка­талитической функции. Так, гликопротеины обычно присоединя­ют к носителю через углеводную, а не через белковую часть моле­кулы фермента.

Число методических приемов, разработанных для осуществле­ния ковалентной иммобилизации ферментов, исключительно ве­лико. Все методы химической иммобилизации классифицируют в зависимости от природы реакционной группы носителя, вступа­ющей во взаимодействие с молекулой фермента. Ниже представ­лен ряд примеров, иллюстрирующих некоторые способы хими­ческой иммобилизации ферментов.

Иммобилизация ферментов на носителях, обладающих гидроксо- группами. Наиболее распространенным методом образования ко­валентной связи между ферментом и полисахаридным носителем или синтетическим диольным соединением является бромциано- вый метод, который был предложен Р.Аксеном, Дж.Поратом и С. Эрнбаком в 1967 г. При обработке носителя бромцианом возни­кают реакционноспособные цианаты и имидокарбонаты, кото­рые при взаимодействии с нуклеофильными аминогруппами фер­мента образуют производные изомочевины и уретанов:

-S-S-Ф + Н,0

Иммобилизация путем химического присоединения биоката­лизатора к носителю отличается высокой эффективностью и проч­ностью связи. Несмотря на это, методы ковалентной иммобили­зации ферментов все еще малодоступны для промышленного ис­пользования в связи со сложностью и дороговизной их примене­ния. Однако они остаются незаменимыми инструментами в прак­тике проведения научных и лабораторных исследований по созда­нию энзимов с контролируемыми свойствами.

4.6.3. Иммобилизация клеток

Методы иммобилизации универсальны для всех видов иммо­билизованных биокатализаторов — индивидуальных ферментов, клеток, субклеточных структур, комбинированных препаратов.

Наряду с иммобилизацией ферментов в последнее время все большее внимание уделяется иммобилизации клеток и субклеточ­ных структур. Это объясняется тем, что при использовании иммо­билизованных клеток отпадает необходимость выделения и очис­тки ферментных препаратов, применение кофакторов; создается возможность получения полиферментных систем, осуществляю­щих многостадийные непрерывно действующие процессы.

В промышленных процессах чаще используют покоящиеся клетки. Действительно, многие хозяйственно-ценные продукты синтезируются главным образом в стационарной фазе развития клеточных культур. Растущие клетки нарушают структуру носи­теля. Образующиеся при делении дочерние клетки, покидая но­ситель, загрязняют целевой продукт. Для подавления роста им­мобилизованных клеток растений используют дефицит фитогор- монов, а рост клетки бактерий тормозят добавлением антибио­тиков.

Иммобилизованные клетки микроорганизмов применяют для биотрансформации органических соединений, разделения раце­мических смесей, гидролиза ряда сложных эфиров, инверсии са­харозы, восстановления и гидроксилирования стероидов. Иммо­билизованные хроматофоры используют в лабораторных установ­ках для синтеза АТФ, а пурпурные мембраны — для создания искусственных фотоэлектрических преобразователей — аналогов солнечных батарей. Разрабатывается реактор на основе иммоби­лизованных клеток дрожжей для получения этанола из мелассы, в котором дрожжи сохраняли бы способность к спиртовому броже­нию в течение 1800 ч. Из более чем 2000 известных в настоящее время ферментов иммобилизована и используется для целей ин­женерной энзимологии примерно десятая часть (преимуществен­но оксидоредуктазы, гидролазы и трансферазы).

Для осуществления химических процессов с помощью иммо­билизованных ферментов применяют колоночные, трубчатые, пла­стинчатые и танкерные реакторы разного объема и производи­тельности. Иммобилизованные ферментные системы функциони­руют в биореакторе в виде неподвижной фазы, через которую про­текает среда с субстратом, подлежащим химическому превраще­нию (гетерогенный катализ). В таких реакторах наряду с непрерыв­ным режимом используется и периодический. Для эффективного перемешивания и газообмена биореактор снабжают мешалкой. По­вреждающее действие мешалки на биокатализатор устраняют, зак­репляя определенным образом его гранулы. Например, в биореак­торе «корзиночного» типа мешалка вращается в полом цилиндре из сетчатой структуры (корзина), в ячейках которой закреплен им­мобилизованный фермент. Во внутреннем объеме трубчатых реак­торов рыхло расположены полые волокна, заполненные биоката­лизатором. Степень превращения субстрата в продукт (например, фумарата аммония в аспартат) в таких реакторах достигает 90 %.

4.6.4. Промышленные процессы с использованием иммобилизованных ферментов и клеток

Сочетание уникальных каталитических свойств энзимов с пре­имуществами иммобилизованных ферментов как гетерогенных катализаторов позволило создать новые промышленные техноло­гические процессы. Следует отметить, что все они относятся к производству пищевых продуктов и лекарственных препаратов.

В настоящее время в мире разработаны следующие крупномас­штабные производства с использованием иммобилизованных фер­ментов и клеток:

1. Получение глюкозофруктозных сиропов.

2. Получение оптически активных L-аминокислот из их раце­мических смесей.

3. Синтез L-аспарагиновой кислоты из фумарата аммония.

4. Синтез L-аланина из L-аспарагиновой кислоты.

5. Синтез L-яблочной кислоты из фумаровой кислоты.

6. Получение безлактозного молока.

7. Получение Сахаров из молочной сыворотки.

8. Получение 6-аминопенициллановой кислоты.

В качестве примера рассмотрим некоторые из них.

Получение глюкозофруктозных сиропов. Фруктоза (фруктовый, плодовый или медовый сахар) — важнейший в физиологическом и технологическом отношении природный моносахарид. Превра-. щаясь в печени и кишечнике млекопитающих в глюкозу, фрукто-: за включается в пластический и энергетический обмен клетки. Она в 2,5 раза слаще глюкозы и в 1,7 раза слаще тростникового сахара (сахароза), благодаря чему фруктоза — менее калорийный пище­вой продукт по сравнению с последними. В отличие от глюкозы обмен фруктозы не контролируется инсулином, поэтому фрукто­вый сахар может потребляться больными диабетом. Фруктоза прак­тически не вызывает кариеса зубов. В смеси с глюкозой фруктоза не кристаллизуется, поэтому широко используется для производ­ства кондитерских изделий.

Объем производства сахарозы за последние 100 лет возрос в 15 раз и составляет, по разным оценкам, 30 — 40 кг в год на человека. Однако, несмотря на явные преимущества использования фрук­тозы, первая промышленная установка для превращения глюко­зы во фруктозу с помощью иммобилизованной глюкоизомеразы была запущена лишь в 1973 г. (компания «Клинтон Корн», США). Исходным сырьем для этого процесса служит глюкоза, которую получают при гидролизе кукурузного или картофельного крахма­ла в присутствии минеральных кислот. Для конструирования про­мышленного биокатализатора глюкозоизомеразу сорбируют на пористых неорганических носителях или ионообменных смолах. Во многих случаях используют иммобилизованные клетки разно­го происхождения {Aspergillus niger, A. oryzae, Streptomyces phaeochro- mogenes, S. olivaceus, S. venezuelae). Коммерческие препараты им­мобилизованной глюкоизомеразы имеют вид гранул, шариков, волокон или аморфной массы. Наиболее эффективными биореак­торами для получения фруктозы признаны аппараты колонного типа высотой около 5 м, в которых по сравнению с реакторами перемешивания расход фермента минимален. Производительность такого реактора варьирует от 600 до 9000 кг глюкозофруктозного сиропа на 1 кг иммобилизованного фермента в зависимости от чистоты исходного сырья, а время полуинактивации катализато­ра — 20 — 50 суток. Возникающий в результате каталитического процесса глюкозофруктозный сироп содержит 42 —45 % фрукто­зы, около 51 % глюкозы, небольшое количество олигосахаридов и по сладости соответствует инвертному сахару, получаемому при гидролизе сахарозы. Эти смеси постепенно вытесняют инвертиро­ванный сахар в промышленности и медицине. Глюкозофруктоз- ную смесь широко применяют для производства тонизирующих напитков, консервированных фруктов, кондитерских изделий, хле­ба, мороженого и пр. Экономические расчеты показали, что про­изводство глюкозофруктозных сиропов с использованием иммо­билизованной глюкоизомеразы в 1,5 раза выгоднее получения са­харозы из сахарной свеклы по традиционной технологии. Благо­даря этому обстоятельству производство глюкозофруктозных си­ропов в мире постоянно растет. Так, в 1980 г. 10 % потребляемого населением Японии сахара заменено на глюкозофруктозную смесь. В США эта доля к началу нового столетия достигла 40 %.

Получение L-аминокислот из их рацемических смесей. Наряду с микробиологическими способами важное значение имеют химические методы промышленного получения природных амино­кислот, в том числе незаменимых. Однако в результате химических реакций, используемых для синтеза аминокислот, содержащих асим­метрические атомы углерода, с одинаковой скоростью образуются как D-, так и L-стереоизомеры, т.е. всегда возникает рацемическая смесь. Между тем в живых клетках обмену подвергаются лишь L-аминокислоты. Разделение рацемических смесей на составляющие их оптические изомеры (представляющее труднейшую задачу) яви­лось первым промышленным процессом с использованием иммо­билизованных ферментов. Этот процесс был осуществлен в Японии в 1969 г. (компания «Танабе Сейяку») с помощью аминоацилазы, иммобилизованной на ДЕАЕ-целлюлозе. В качестве исходных соедине­ний в данном превращении используют N-ацилированные произ­водные D-,L-аминокислот, получаемые с помощью химического синтеза. Вследствие своей стереоспецифичности аминоацилаза гидро-" лизует лишь N-auwi-L-стереоизомер, отщепляя от него ацильный'. радикал, в результате чего растворимость образующейся L-амишИ! кислоты резко возрастает и ее легко можно отделить от своего анти-1 пода физико-химическими методами. При нагревании оставшаяся! N-ацил-О-аминокислота рацемизируется, т.е. превращается в ис->1 ходную смесь, которая вновь подвергается воздействию фермента:

_ + Н₂0 СООН СООН

2R СН—СООН Аминоацилаза I I

I ----------------------- _р » HjN-C-H + H-C-NH-CO-R ¹

NH-CO-R, -R,COOH ² i I

R R

М-ацил-0-,Ь-амино- L-аминокислота Ы-ацил-О-амино-

кислота кислота

+_______________________________________ I

Рацемизация при нагревании

Аминоацилаза строго специфична к структуре только ациль- ной части субстрата, поэтому одна и та же установка с иммоби­лизованным ферментом используется для получения различных аминокислот, в том числе L-валина, L-метионина, L-фенилала- нина и L-триптофана. Время полуинактивации иммобилизован­ного энзима составляет 65 суток; на японских предприятиях он используется без замены более 8 лет и обеспечивает снижение стоимости производства аминокислот на 40 % по сравнению с тех­нологией, где применяются свободные молекулы фермента.

Получение L-аспарагиновой кислоты. Аспарагиновая кислота широко употребляется в качестве пищевой добавки (подсласти­тель и подкислитель). Первая в мире промышленная установка для синтеза L-аспарагиновой кислоты из получаемого химичес­ким путем фумарата аммония была запущена в 1973 г. в Японии (фирма «Танабе Сейяку»); в ней использованы иммобилизован­ные в полиакриламидном геле клетки кишечной палочки Е. coli, содержащие аспартат-аммиак-лиазу:

Изложенное далеко не исчерпывает перечень химических про­изводств, базирующихся на использовании иммобилизованных ферментов и клеток. Список ряда биотехнологических процессов с применением иммобилизованных биокатализаторов, разрабо­танных на уровне промышленных и опытных установок, пред­ставлен в табл. 4.3.

4.6.5. Ферментативная конверсия целлюлозы в глюкозу

В связи со значительным исчерпанием углеводородного сырь насущной проблемой для дальнейшего развития биотехнологи, становится освоение новых сырьевых источников. По существу №- исчерпаемый и одновременно возобновляемый источник сырь представляет собой растительная биомасса (многолетние расте ния, вторичные продукты и отходы их промышленной и сельскс хозяйственной переработки), основным компонентом которой слу жит целлюлоза (клетчатка). Ежегодно на Земле создается окол 100 млрд т целлюлозы.

Благодаря плотной упаковке линейно построенных полигль козидных цепей целлюлоза устойчива к действию большинств растворителей и химических агентов, в том числе сильных кислс В природе существуют так называемые целлюлолитические орг низмы (бактерии, плесневые грибы) и некоторые виды насек» мых, содержащие полиферментные комплексы целлюлаз, обе печивающие гидролиз клетчатки до глюкозы. Целлюлазный ком» леке ферментов включает эндо-1,4-(3-глюканазу, экзоцеллоби гидролазы, целлобиазы и экзо-1,4-р-глюкогидролазу, механи| действия которых на клетчатку оказался одинаковым для всех Щ следованных целлюлазных комплексов независимо от их npoi хождения. Попадая на целлюлозосодержащие материалы, мик|. организмы выделяют целлюлазы, которые, сорбируясь (иммобш

зуясь) на субстрате, постепенно расщепляют его до глюкозы. В пос­ледние годы разработаны технологические схемы для непрерывно­го ферментативного гидролиза целлюлозы на уровне опытных ус­тановок. Процесс протекает в противоточных реакторах колонного типа, плотно заполненных целлюлозой. Расчеты показывают, что перевод процесса на промышленный уровень обеспечивает полу­чение 24 т глюкозы в сутки. Дальнейшее совершенствование эф­фективности метода конверсии целлюлозосодержащего сырья в глюкозу и далее в этанол и углеводороды позволит создать альтер­нативные пути получения ценных моносахаридов и жидкого топлива из возобновляемого сырья, а также решить еще одну важную про­блему — утилизацию экологически опасных отходов производства.

4.6.6. Биосенсоры на основе иммобилизованных ферментов

Высокая эффективность биологических катализаторов и спе­цифичность их действия делают ферменты идеальными реагента­ми для аналитической химии. Благодаря этим особенностям с по­мощью ферментов обнаруживаются вещества при предельно низ­кой концентрации в присутствии множества других соединений. К настоящему времени созданы искусственные аналитические системы различных конструкций (биосенсоры, датчики, фермент­ные электроды, проточные анализаторы), содержащие иммоби­лизованные ферменты и клетки и предназначенные для автома­тического детектирования продуктов энзиматического превраще­ния. Например, если использовать иммобилизованную глюкозо- оксидазу, то концентрацию окисляемой кислородом глюкозы определяют, регистрируя количество выделившегося в ходе реак­ции пероксида водорода:

Н Н ОНН

^ ' J, J, J, ^О Глкжозооксидаза

нон₂с—с—с—с—с—сС_н +0₂ + Н₂0 ---------------------------

ОН ОНН ОН

Н Н ОНН

—- нон₂с—с—с—с—с—ct + Н₂0₂

I I I I ^он ОН ОНН он

В зависимости от концентрации анализируемых веществ выби­рают тот или иной способ их детекции. Так, количественное со­держание пероксида водорода (ммоль/л) можно определить од­ним из нижеследующих методов:

Полярографический (накопление Н₂0₂)................................................ 0,1

Колориметрический (Н₂0₂ + О-дианизи-

пероксидаза „ nimi дин................................................ окрашенный продукт) 0,1-10 ^J

Люминесцентный (Н₂0₂ + люминол —ь-

хемилюминесцентный продукт, х_макс = 425 нм)....................... 0,1 • 10~⁶

Начаты разработки новых поколений биодатчиков на базе аф­финных взаимодействий (биосродства) типа фермент-ингибитор, антитело-антиген, агонист (антагонист)-клеточный рецептор, а также на основе полупроводниковых структур и мезоэлектричес- кого эффекта. Последние два биодатчика дают возможность созда­вать сенсоры, чувствительные к газам, что имеет существенное значение для создания роботов, реагирующих на изменения внеш­них воздействий.

Технологические варианты реакторов с иммобилизованными ферментами весьма разнообразны — колонки, трубки, полые во­локна и пр. С их помощью на практике определяют концентрацию широкого спектра соединений — глюкозы, аминокислот, моче­вины, пенициллина, АТФ, НАДН, ФМН, стероидов, триглице- ридов, желчных кислот и многих других (J.Aylott, R. Kopelman, 2000). Так, американскими исследователями сконструирован мик­родатчик на основе глюкозооксидазы и рутениевого красителя, иммобилизованных в полиакриламидной матрице с использова­нием субмикронных оптических волокон. Микробиосенсор, не вы­зывая повреждений, может быть введен в клетку и даже в отдель­ные ее компартменты для измерения содержания в них глюкозы и кислорода. Предложены датчики на базе иммунодетекции для про­ведения экспресс-анализов на присутствие производных диокси­на (Nomura et. al., 2000) и оценки содержания биогенных аминов (с помощью моноаминооксидазы) в пищевых продуктах в связи с процессами их старения. Для определения мочевины ферментным электродом требуется всего 30 с.

Биосенсоры на основе иммобилизованных ферментов помога­ют выполнять десятки быстрых и точных анализов при диагности­ке заболеваний, контролировать содержание вредных веществ (ин­сектицидов, пестицидов, удобрений) в пищевых продуктах и в воздухе. Биосенсоры нашли применение в решении аналитичес­ких задач в химической и микробиологической промышленнос­ти, а также в научных исследованиях.

4.6.7. Иммобилизованные ферменты в медицине

Иммобилизованные ферменты имеют огромное значение для медицины. В частности, большой рынок сбыта занимают тромбо- литические ферменты, предназначенные для борьбы с сердечно­сосудистыми заболеваниями. Так, в отечественную клиническую практику внедрен препарат «стрептодеказа», содержащий стреп- токиназу — активатор предшественника протеиназы плазмина, предотвращающий образование тромба в кровеносной системе.

Ферменты, разрушающие некоторые незаменимые аминокисло­ты (например, аспарагиназа), используют для борьбы со злокаче­ственным ростом опухолей. Протеолитические ферменты (трип­син, химотрипсин, субтилизин, коллагеназа), иммобилизован­ные на волокнистых материалах (целлюлоза, полиамидные волок­на, декстран и др.), применяют для эффективного лечения ран, язв, ожогов, абсцессов, а их белковые ингибиторы — в замести­тельной терапии для лечения эмфиземы и панкреатитов.

Исключительно важны с практической точки зрения работы, посвященные направленному транспорту лекарственных веществ. В этом отношении особенно выгодны инкапсулированные фер­менты типа искусственной клетки. Так, микрокапсулы, стенки которых представлены оболочкой эритроцита («тень эритроцита»), а их содержимое заполнено ферментом аспарагиназой, перено­сятся кровотоком к зонам скопления аспарагина и поэтому при­меняются для лечения аспарагинзависимых опухолей, в частно­сти саркомы. Колонки, заполненные микрокапсулами с фермен­том, используют для диализа в аппарате «искусственная почка», которая работает в 100 раз эффективнее обычного аппарата.

Таким образом, использование иммобилизованных ферментов во многих жизненно важных отраслях народного хозяйства стано­вится все более массовым. Выгодное сочетание избирательности и эффективности с долговечностью и стабильностью иммобилизо­ванных ферментов в корне меняет химическое производство, спо­собы добывания сырья, способствует созданию новых биотехно­логических процессов и методов терапии, совершенствует меди­цинскую диагностику, анализ, органический синтез и оказывает огромное влияние на образ жизни человека.

Глава 5

ОСНОВЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ

5.1. ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ

Генетическая инженерия — ветвь молекулярной генетики, ис­следующая возможности и способы создания лабораторным пу­тем (in vitro) генетических структур и наследственно измененных организмов, т.е. создания искусственных генетических программ, с помощью которых направленно конструируются молекулярные генетические системы вне организма с последующим их введени­ем в живой организм. Обычно употребляют два названия данного научного направления — генетическая инженерия и генная инже­нерия, являющиеся как бы синонимами. Однако их смысловое со­держание неодинаково: генетическую инженерию связывают с ге­нетикой, а генная имеет отношение только к генам. Кроме того, генетическая инженерия точнее раскрывает содержание дисцип­лины — создание генетических программ, основная задача кото­рых — создание in vitro молекул ДНК посредством соединения фрагментов ДНК, которые в естественных условиях чаще не со­четаются благодаря межвидовым барьерам (рекомбинантные ДНК). Молекула рекомбинантной ДНК представляет собой соединенные в бесклеточной системе два компонента: вектор, обеспечивающий механизм репликации и экспрессии, и фрагмент клонируемой («чу­жеродной») ДНК, содержащий интересующие исследователя гене­тические элементы. Согласно определению национальных институ­тов здоровья США, «рекомбинантными ДНК называют молекулы ДНК, полученные вне живой клетки путем соединения природных или синтетических фрагментов ДНК с молекулами, способными реплицироваться в клетке». Генетическая инженерия возникла на стыке многих биологических дисциплин: молекулярной генетики, энзимологии, биохимии нуклеиновых кислот и др. Первая реком- бинантная ДНК получена в 1972 г. (П. Бергом с сотр.) и была со­ставлена из фрагмента ДНК обезьяньего вируса ОВ40 и бакте­риофага X dvgal с галактозным опероном Е. coli. Формально 1972 г. следует считать датой рождения генетической инженерии.

Генетическая инженерия имеет яркую историю благодаря тому общественному резонансу, который она вызвала с самых первых своих шагов. Начало этим событиям положило послание участни­ков Гордоновской конференции (1973) президиуму АН США, в котором говорилось о возможной опасности технологий рекомби- нантных ДНК для здоровья человека. Возможные блага генети­ческой инженерии признавались с самого начала, но разногла­сия по данной проблеме не затихли и сейчас. В табл. 5.1 перечисле­ны основные этапы становления и развития генетической инже­нерии.

5.2. БИОТЕХНОЛОГИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК

Технология рекомбинантных ДНК включает набор как новы; методов, так и заимствованных из других дисциплин, в частности из генетики микроорганизмов. Эти методы существенно расширя­ют возможности генетических исследований. Используя техноло­гию рекомбинантных ДНК, получают даже минорные клеточные белки в больших количествах и проводят тонкие биохимические исследования структуры и функций белков, а также осуществля­ют детальный химический анализ генетического материала. К наи­более важным методам биотехнологии рекомбинантных ДНК сле­дует отнести следующие: