БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ 5 страница

В последние годы достигнуты большие успехи в расшифровке молекулярного механизма действия антибиотиков. Наиболее яркая особеннность антибиотиков — исключительная специфичность их действия. По выражению П. Эрлиха, антибиотики — это магичес­кие пули. Специфика действия их состоит в избирательном подав­лении этими эффекторами одного или нескольких процессов лишь у некоторых микроорганизмов. Таким образом, антибиотики бло­кируют метаболические мишени в клетках-мишенях. В зависимости от специфики действия антибиотиков на молекулярном уровне раз­личают следующие группы соединений, вызывающие у бактерий:

1) нарушение биосинтеза пептидогликанов клеточной стенки (пенициллины, ванкомицин, цефалоспорины);

2) нарушение отдельных этапов процессов трансляции (амфени- колы, аминогликозиды, тетрациклины, макролиды, линкосамиды);

3) повреждения цитоплазматической мембраны (грамицидин, полимиксины);

4) нарушение биосинтеза нуклеиновых кислот (рифамицины, актиномицин D, противоопухолевые антибиотики);

5) нарушение энергетического обмена (олигомицин, хлоргек- сидин).

Антибиотики широко используют в качестве молекулярных инструментов при исследовании фундаментальных проблем био­логии, таких, как расшифровка тончайших механизмов биосин­теза белка, нуклеиновых кислот и структуры клеточных стенок бактерий, создание моделей транспорта ионов через биологичес­кие мембраны и др.

Изыскание новых антибиотиков обусловлено как потребностя­ми практики, так и накоплением резистентных форм микроорга­низмов по отношению ко многим антибиотикам. Устойчивость бактерий к пенициллинам и цефалоспоринам создает присутству­ющий в их клетках энзим лактамаза (пенициллиназа). Фермент гидролизует амидную связь (3-лактамного цикла в молекуле анти­биотика с образованием пенициллиновой кислоты, которая пол­ностью лишена антимикробной активности:

Специальное изучение объема и потенциала защитных свойств микроорганизмов показало, что их резистентность к антибиоти­кам имеет глобальный характер и обеспечивается как разнообра­зием фенотипов резистентности, так и разнообразием и стабиль­ностью систем горизонтального генного транспорта. Поэтому глав­ное направление получения новых антибиотиков состоит не в от­крытии новых соединений, а в химической трансформации при­родных молекул для создания полусинтетических антибиотиков, характеризующихся значительно меньшей резистентностью и ток­сичностью, но более широким спектром действия, большим вре­менем жизни, химической и биологической устойчивостью. Важ­ный подход на пути получения устойчивых аналогов антибиоти­ков — использование природных ингибиторов (3-лактамаз — кла- вулановой и оливановой кислот.

Методы получения антибиотиков путем химического синтеза чрезвычайно сложны и не могут конкурировать с их биосинтезом методами биотехнологии. Существует несколько способов получе­ния как природных, так и полусинтетических антибиотиков. На­правленный биосинтез антибиотиков осуществляется путем пря­мой ферментации микроорганизма — продуцента с подходящим
нии природы его ацильнои группировки при сохранении в неиз­менном виде ядра пенициллина — 6-аминопенициллановой кис­лоты (6-АПК). В промышленности 6-АПК получают путем гидро­лиза природных пенициллинов с помощью специфического фермента — пенициллинацилазы, образующейся с высоким выхо­дом в процессе ферментации ряда штаммов микроорганизмов. Аци- лазы различают по их субстратной специфичности. Некоторые из ацилаз способны катализировать и обратные реакции — процессы ацилирования аминогруппы 6-АПК с образованием модифициро­ванного пенициллина. Таким путем было получено более 40 ООО по­лусинтетических пенициллинов. Существенно, что во многих слу­чаях 6-АПК не выделяют из культуральной жидкости, например при превращении бензилпенициллина в ампициллин:

0=с n Бензилпенициллин

+ Н₂0, пенициллин- ацилаза

сн₃ сн₃ СООН

Бензилпенициллин гидролизуют ацилазой мутанта Kluyvera citrophi- la при рН 7,8 — 8,0 и температуре 40—50 "С. Затем в ферментер вно­сят мутант Pseudomonas melanogenum и фенилглицин. Условия фермен­тации изменяют таким образом (рН 5,0 — 5,5), чтобы ацилаза вто­рого мутантного организма осуществляла синтез ампициллина:

nh₂ 1

Фенилглицин

СН-СООН

0=с n Ампициллин

возникает метициллин, а в слу-

.О

Антибиотики продуцируются плесневыми грибами, актиноми- цетами, эубактериями и другими микроорганизмами. Некоторые из этих организмов способны продуцировать большое количество антибиотиков. Так, 6 родов филаментозных грибов производят около 1000 различных антибиотиков, в том числе пенициллин и цефалоспорин, а три рода актиномицетов — 3000 антибиотиков. Среди актиномицетов наибольший вклад вносит род Streptomyces, один из видов которого — S. griseus синтезирует более 50 антиби­отиков. В процессе образования антибиотиков задействовано зна­чительное число генов. Массовая расшифровка первичной струк­туры геномов микроорганизмов показала, что эта величина равна 1 — 2%. Так, у Bacillus subtilis число таких генов достигает 2 %, что обеспечивает микроорганизму большие возможности для защиты и адаптации. С другой стороны, это обстоятельство затрудняет анализ путей биосинтеза антибиотиков и идентификацию отдель­ных мутаций, способных увеличить выход продукта. Тем не менее большинство известных в настоящее время высокопродуктивных штаммов продуцентов антибиотиков получено традиционными ме­тодами мутагенеза и селекции.

Биосинтез антибиотиков, как и любых других вторичных мета­болитов, возрастает в фазе замедленного роста клеточной популя­ции (конец трофофазы) и достигает максимума в стационарной фазе (идиофазе). Считают, что в конце трофофазы изменяется энзи- матический статус клеток, появляются индукторы вторичного ме­таболизма, освобождающие гены вторичного метаболизма из-под влияния катаболитной репрессии. Поэтому любые механизмы, тор­мозящие клеточную пролиферацию и активный рост, стрессовые ситуации, активируют процесс образования антибиотиков.

Процесс культивирования идиолитов проходит две фазы (дву- степенчатое культивирование). На первой фазе происходит накоп­ление достаточного количества биомассы, которая выращивается на среде для роста микроорганизма. Эта фаза должна быть быст­рой, а питательная среда дешевой. На второй фазе осуществляют­ся запуск и активный синтез антибиотика. На этой фазе фермен­тацию ведут на продуктивной среде.

Образование антибиотиков регулируется условиями культиви­рования микроорганизмов. Поэтому оптимизация питательной сре­ды является главным фактором в повышении выхода продукта. - Специальные опыты показали, что выход цефалоспорина С уменьшается при переходе от использования в качестве источни-. ка углерода сахарозы к быстро усваиваемому углеводу глюкозе. Наиболее оптимальной средой для образования антибиотика куль­турой Streptomyces antibioticus оказалась смесь 0,1 % глюкозы и 1 % галактозы. При таком соотношении моносахаридов глюкоза быст-, ро утилизируется и микроорганизм переключается на усвоение»' галактозы, что и инициирует идиофазу.

Многие антибиотики берут свое начало от промежуточных соединений обмена первичных метаболитов, поэтому их биосинтез, регулируется путем ретроингибирования. Так, биосинтез пеницил­лина культурой гриба Penicillium chrysogenum контролируется по принципу обратной связи L-лизином. Этот эффект объясняется" тем, что биосинтез как пенициллина, так и лизина осуществляет-^ ся через общий предшественник — а-аминоадипиновую кислот/ (см. схему ниже). Торможение лизином первого фермента биосин­теза — гомоцитратсинтазы — приводит к недостатку а-аминоади пиновой кислоты, что снижает выход антибиотика.

Добавление в питательную среду а-аминоадипиновой кислоты предотвращает ингибирующий эффект лизина и активирует био­синтез пенициллина в отсутствие лизина. Кроме ретроингибирова-< ния биосинтез многих антибиотиков тормозится высокими концен­трациями своих же антибиотиков. Следует отметить, что в процессе эволюции микроорганизмы выработали механизмы защиты от дей­ствия собственных антибиотиков. Эта проблема успешно решается,

в результате использования им­мобилизованных ферментов.

Большинство антибиотиков получают при глубинной аэроб­ной ферментации периодичес­кого действия в асептически? условиях. Период ферментацт длится 7—10 суток. В послед­ние годы внедряются полуне­прерывные и непрерывньп. процессы ферментации. Техно­логия завершающих стадии- процесса определяется приро дой антибиотика, характерол производства и целями даль­нейшего использования антг- биотиков. Для медицински" ----- Лизин Бензилпенициллин целей технология выделения *

Отработанный Растворитель растворитель Первый экстрактор

Второй и третий экстрак­торы

Отработанный растворитель

Суспензия

-QSD-

Ленточный фильтр

Растворитель

V

Кристаллическая калиевая соль пенициллина

Центрифуга

IV

Фильтр

¥

Раствор гидрохлорида прокаина

РЬ I

очный! Г то * '

V

\ Сетчатый ^ фильтр

—Вакуум

Лиофильная сушка

Прокаиновая соль пенициллина

Рис. 3.6. Технологическая схема производства пенициллина (по B.Atkinson, F.Mavituna, 1983)

очистки имеет особое значение. Обычно она включает сложные мно­гоступенчатые комбинации различных операций: экстракцию ан­тибиотиков подходящими растворителями, осаждение и перекри­сталлизацию их из разных сред, фракционирование на ионооб­менных смолах, лиофильную и распылительную сушку готовых препаратов (рис. 3.6). Антибиотики выделяют или в виде сравни­тельно неочищенных препаратов (натриевая соль пенициллина), или в виде высокоочищенных веществ (прокаиновая соль пени­циллина), предназначенных для клинического использования. Вы­ход антибиотиков обычно составляет несколько десятков граммов на 1 л.

3.5.2. Получение промышленно важных стероидов

Прогестерон

Способность клеток микроорганизмов к сложнейшим процес­сам биотрансформации наиболее полно реализовалась при полу­чении промышленно важных стероидов. Использование абсолют­ной субстратной специфичности и стереоспецифичности биоло­гических катализаторов, присущих целым клеткам микроорганиз­мов, позволило разработать условия осуществления множества химических реакций для структурных перестроек стероидов. В ре­зультате были получены новые соединения с лучшими фармаколо­гическими свойствами. Биотрансформация стероидов обычно заклю­чается в селективном воздействии на одно из положений стероид­ного скелета. Первый промышленный процесс микробной био­трансформации стероидов основывался на технологии направлен­ного гидроксилирования (11-а-гидроксилирование) прогестерона:

11-а-Гидроксипрогестерон

Значимость разработанной микробной трансформации опре­деляется тем, что процессы гидроксилирования кортикостерона и его производных лежат в основе промышленного получения многих ценных продуктов: противовоспалительных и противоопу­холевых препаратов, трансквилизаторов, анестезирующих средств, половых гормонов и пр.

Так, производство в промышленном масштабе важнейшего про­тивовоспалительного препарата — преднизолона — осуществля­
ется путем микробного гидроксилирования кортикостерона (см. схему ниже).

Правильность преобразования стероидного субстрата контро­лируют, сочетая химический подход со специфичностью биоло­гической системы. Например, образование уксуснокислого эфира по С-17-субстрата стереохимически препятствует другим побоч­ным реакциям.

Важнейший источник стероидных гормонов — культура кле­ток растений. Так, культура клеток диоскореи дельтовидной (Dioscorea deltoidea) корневого происхождения продуцирует фи- тостерин диосгенин и его гликозидные производиые (сапонины). Существенно, что способность к сверхсинтезу фуростаноловых гли- козидов ряда штаммов диоскореи, например штамма ДМ-ОГ, ста­бильно поддерживалась в течение 27 лет (Р. Г. Бутенко, 1999). Та­ким образом, культивирование кле­ток растений in vitro представляет со­бой новое решение проблемы про­мышленного получения вторичных метаболитов.

Дальнейшие успехи в производ­стве стероидных препаратов связы­вают с применением иммобилизо­ванных клеток, использованием оп­тимального сочетания биологических и химических превращений, а также с совершенствованием технологии очистки получаемых соединений. Среды для биотрансформации име­ют достаточно сложный состав, а ре­акция требует строгого контроля за каждым ее параметром (рН, время и т.д.). Так, среда для осуществления реакции окисления кортизола в пред- низолон культурой клеток Arthrobacter simplex включает пептон, глюкозу и кукурузный экстракт. Через сутки к смеси добавляют вещество S Рейхш- тейна. Процесс ведут строго в нейт­ральной среде при температуре 28 °С в течение 120 ч. Выход преднизолона составляет 93 %.

СН,ОН I С=0 Curvularia lunata

СН2ОН I С=0 Кортизол Arthrobacter simplex

СН2ОН I С=0 Преднизолон

Разработка крупномасштабного производства преднизолона путем биотрансформации стероидов позво­лила снизить стоимость этого препа­рата в 200 раз.

Глава 4

БИОИНДУСТРИЯ ФЕРМЕНТОВ

4.1. ПРИМЕНЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ

Ферменты сохраняют свои уникальные свойства (эффективность, специфичность действия) вне клеток, поэтому их традиционно ши­роко применяют в практике. Биологические катализаторы неток­сичны, работают в мягких условиях, используют доступное сырье (в том числе и отходы), в связи с чем их применение в промышлен­ности выгодно с экономической и экологической точек зрения.

По объему производства ферменты занимают третье место после аминокислот и антибиотиков. Из более чем 2000 известных в настоя­щее время ферментов в промышленности используется около 30. Основная часть ферментов, поступающих на мировой рынок, прихо­дится на долю гидролаз, из которых 60 % составляют пептидогид- ролазы (в основном щелочные и нейтральные протеазы), исполь­зующиеся в качестве детергентов в производстве синтетических мою­щих средств, а 30 % — гликозидазы, применяющиеся в производ­стве кондитерских изделий, фруктовых и овощных соков. Фермен­ты находят применение в текстильной, кожевенной, целлюлозо- бумажной, медицинской, химической промышленности (табл. 4.1).

По прогнозам ученых, основным потребителем ферментов в ближайшем будущем остается пищевая промышленность. Главное место среди этих энзимов занимают глюкоизомераза и глюкоами- лаза, применяющиеся для приготовления обогащенных фрукто­зой кукурузных сиропов и составляющие около 50 % рынка пи­щевых энзиматических препаратов.

Все большее развитие получают технологические процессы с участием сложных энзиматических систем, включающих кофер- менты. Так, созданы ферментные мембранные реакторы, катали­зирующие непрерывные процессы с регенерацией НАДН (вос­становительное аминирование кетокислот, восстановление а-ке- токислот в а-гидроксикислоты). Разработаны системы разделения рацематов посредством стереоспецифического активного транс­порта. Например, мембрана, содержащая гексокиназу и фосфата-

Применение ферментов

Химический и биотехнологический процессы. Область использования

Амилазы (КФЗ.2.1.1 КФ 3.2.1.2 КФ 3.2.1.3)

Глюкоизоме- раза

(КФ5.3.1.18)

Глкжоокси-

даза

(КФ 1.1.3.4) и каталаза (КФ 1.11.1.6)

Липазы (КФ 3.1.1.3)

Пектиназа (КФЗ.2.1.15)

Пептидогид- ролазы (КФ 3.4)

Бактерии, грибы (Bacillus sp., Aspergil­lus niger, A.oryzae)

Более 80 видов мик­роорганизмов (Bacillus sp., Streptomyces albus, S.griseus)

Penicillium chrysoge- num, P.casei, P. nigri­cans, P.notatum, P.vi- tak, Aspergillus niger, Corynebacterium ssp.)

Поджелудочные же­лезы животных, семе­на растений, микро­организмы (Candida lipolytica, Streptomyces flavogriseus, Aspergillus ssp., Saccharomyces lipolytica)

Многие микроорга­низмы (Aspergillus ssp., Fusarium ssp., Peni- cillum ssp.H др.)

Поджелудочные желе­зы и слизистая желуд­ка животных; плоды, побеги, отходы пере­работки некоторых растений (дынное де­рево, инжир, ананас), микроорганизмы (Ba­cillus ssp., Aspergillus ssp., Penicillium ssp., Streptomyces ssp., Pseu- domonasssp.)

Гидролиз крахмала до декстри­нов, мальтозы и глюкозы. Спир­товая, пивоваренная промыш­ленность, хлебопечение, полу­чение патоки, глюкозы

Изомеризация D-глюкозы в D-фруктозу. Кондитерская, ли- кероводочная, безалкогольная промышленность, хлебопечение

Удаление кислорода и глюкозы (из яичного порошка, мясных и других продуктов). Виноделие, пивоваренная, консервная, соко­вая и безалкогольная промыш­ленность

Гидролиз жиров и масел. Пищевая, легкая, медицинская промышленность, сельское хо­зяйство, коммунальное хозяй­ство, бытовая химия

Гидролиз галактуронана, освет­ление вина и фруктовых соков

Лизис белка. Получение амино­кислот, производство и получе­ние сыра, мягчение мясных и рыбных изделий, вьщелка кожи, активизация пищеварения.Пиво­варение, виноделие, хлебопече­ние, пищевая промышленность, сельское хозяйство, медицина

зу, функционирует как насос, избирательно прокачивающий лишь D-глюкозу. Применение сопряженных ферментативных реакций с участием алкогольоксидазы и катал азы дрожжей Hansenulla polimorpha и формальдегиддисмутазы бактерии Pseudomonas putida позволило осуществить окисление метанола в муравьиную кислоту с выхо­дом 88 — 94%. В промышленности большое будущее имеют фер­менты, способные катализировать химические реакции в органи­ческой фазе, в частности липазы. Существенно, что каталитичес­кая активность панкреатической липазы свиньи сохраняется при концентрации воды в реакционной среде, составляющей всего 0,015 %, и при температуре 100 "С. Препараты липазы используют для синтеза оптически чистых сложных эфиров и феромонов, при­меняющихся в парфюмерии и медицине.

Для деградации и модификации антропогенных органических соединений, поступающих в окружающую среду, используют фер­менты разных классов и в том числе лакказу, лигниназу, тирози- назу, монооксигеназу, диоксигеназу и др. Перспективна для очи­стки сточных вод новая технология, основанная на использова­нии реакции пластеинообразования, открытой А.Я. Данилевским в 1886 г. Сущность работ Данилевского состоит в эксперименталь­ном доказательстве обращения протеолиза и возможности синтеза белковоподобных веществ (пластеинов) под действием ряда про- теолитических ферментов. Сточные воды содержат аминокислоты и пептиды, концентрация которых возрастает в результате гидролиза белковых компонентов отходов под воздействием пептидогидролаз микроорганизмов. Данная технология, активно внедряющаяся во

Франции, нацелена на производство в промышленных масштабах кормовых белков из аминокислот и пептидов сточных вод.

Ферменты широко используют в медицине, например в заме­стительной терапии в составе лечебных препаратов. Пероральное введение фенилаланин-аммиак-лиазы снижает уровень фенила- ланина в крови при фенилкетонурии. Протеолитические фермен­ты, амилазу и липазу применяют при заболеваниях желудочно- кишечного тракта и печени. В последние годы накопились данные об эффективности применения протеиназ в энзимотерапии зло­качественных новообразований. Это объясняется большей проницае­мостью мембран раковых клеток для гидролитических ферментов в сравнении с нормальными клетками, благодаря чему опухоле­вые клетки быстро лизируются при введении смеси протеиназ (препарат «папайотин»), Протеолитические ферменты — плазмин и активирующие его стрептокиназу и урокиназу используют для растворения тромбов в кровеносных сосудах; коллагеназу — для рассасывания рубцовых образований; эластазу — для задержки раз­вития атеросклероза; лизоцим — для лечения конъюнктивитов; дезоксирибонуклеазу из стрептококка (стрептодорназа) — для ле­чения заболеваний верхних дыхательных путей и роговицы глаза.

Важнейшую область применения ферментов в медицине со­ставляет энзимодиагностика — тестирование патологии того или иного органа человека по уровню активности фермента или соот­ношению его множественных форм и изоферментов. Так, аспар- татаминотрансфераза, изоцитратдегидрогеназа, лактатдегидрогеназа и альдолаза служат для выявления инфаркта миокарда; аланина- минотрансфераза, аспартатаминотрансфераза и лактатдегидроге­наза — для диагностики заболеваний печени; глутамилтрансфера- за — для блокировки отторжения органов при их пересадке и т.д.

Таким образом, производство ферментных препаратов зани­мает одно из ведущих мест в современной биотехнологии и отно­сится к тем ее отраслям, объем продукции которых постоянно растет, а сфера применения неуклонно расширяется. По объему производства ферментов доминируют страны Западной Европы. Резкий рост этой индустрии наблюдается в США и Японии.

4.2. ИСТОЧНИКИ ФЕРМЕНТОВ

Ферменты присущи всем живым существам, однако для их выделения используют те природные объекты, в которых содер­жание искомого энзима составляет не менее 1 %. Для крупномас­штабного получения ферментов пригодны только некоторые рас­тительные организмы на определенной фазе их развития (пророс­шее зерно различных злаков и бобовых, латекс и сок зеленой массы ряда растений), а также отдельные ткани и органы живот­ных (поджелудочная железа, слизистая оболочка желудочно-ки- шечното тракта, сычуг крупного рогатого скота, семенники по­ловозрелых животных). Практически неограниченный источник ферментов — микроорганизмы (бактерии, грибы, дрожжи), со­держащие набор большинства известных в настоящее время энзи­мов, количество которых можно повысить в десятки и сотни раз методами мутагенеза, селекции и индукции биосинтеза.

4.3. ТЕХНОЛОГИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ - ПРОДУЦЕНТОВ ФЕРМЕНТОВ

В зависимости от источника технология получения фермент­ных препаратов имеет свои особенности. При извлечении фер­ментов из растительного сырья и животных тканей технология сводится к экстракции энзимов и очистке их от сопутствующих балластных веществ. Технология ферментных препаратов микроб­ного происхождения более сложная, так как дополнительно вклю­чает этапы культивирования микроорганизмов — продуцентов ферментов, в том числе этапы получения посевного материала и производственной культуры соответствующего микроорганизма.

Для производства посевного материала используют исходный штамм продуцентов, получаемый из лабораторных чистых культур, который выращивают разными способами на предварительно стери­лизованной твердой или жидкой питательной среде до определенного возраста. Посевной материал консервируют (высушиванием или хра­нением при низких температурах) вплоть до дальнейшего исполь­зования. Производственные культуры продуцента получают, выра­щивая посевной материал микроорганизмов как на поверхности твердых или жидких сред, так и в глубине жидких питательных сред.,