БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ 3 страница

Достижения в области молекулярной биологии и молекулярной генетики позволили биотехнологам начиная с 70-х годов прошед­шего столетия перейти от слепого отбора штаммов мутантов к со­знательному конструированию геномов, используя для этой цели прогрессивную технологию рекомбинантной ДНК.

Каждое из множества разнообразных веществ создается в клет­ке в строго необходимых для роста пропорциях в результате фер­ментативных реакций. Координация химических превращений. обеспечивающая экономность метаболизма, осуществляется у мик­роорганизмов тремя основными механизмами: регуляцией актив­ности ферментов, в том числе путем ретроингибирования; регу­ляцией объема синтеза ферментов (индукция и репрессия био­синтеза ферментов); катаболитной репрессией.

В процессе ретроингибирования (ингибирование по принцип¹ обратной связи) активность фермента, стоящего в начале много­ступенчатого превращения субстрата, тормозится конечным ме таболитом, что детально разработано при изучении регуляции био­синтеза пиримидиновых нуклеотидов и новообразования ряда ами Нокислот:

Аспар-—► Карбамил—Дигидро- —Оротовая —»- Оротидин—►умФ.

тат аспартат оротовая кислота монофосфат

_ кислота

Карбамил-

трансфераза ----------------------------------------------------------------------

Орнитин —- Цитруллин — Орнитин

Ацетил- трансфераза

Хоризмат —»-Антранилат...—»- Индолил- —►Триптофан

глицерофосфат

Антранилат-

синтетаза

Таким способом низкомолекулярные метаболиты передают ин­формацию об уровне своей концентрации и состоянии обмена ве­ществ ключевым ферментам метаболизма. Ключевые ферменты — это регуляторы периодичности в процессе функционирования энзи­ма и соответственно образования продукта. Эта ферменты представле- _НЬ1 в клетке аллостерическими белками, а конечные метаболиты — тдлостерическими эффекторами (активаторами и ингибиторами) ключевых энзимов. С помощью описанного механизма конечные продукты саморегулируют свой биосинтез. Ретроингибирование — способ точного и быстрого регулирования образования продукта.

На обмен веществ, аналогичный конечным метаболитам, ока­зывают эффект их аналоги (табл. 3.1). Указанное обстоятельство используется для селекции организмов с нарушением механизма обратной связи. Обход механизма ретроингибирования делает объект биотехнологического процесса нечувствительным к кон­центрации конечного продукта.

Для отбора объектов продуценты выращивают на селективной среде, содержащей подходящий аналог или антиметаболит, кото­рые не включаются в обмен веществ (в частности, аналоги ами­нокислот не включаются в состав белков), что ведет к подавле­нию роста организма. Выжившие мутанты обладают дефектами в механизме регуляции активности фермента по принципу обрат­ной связи и поэтому служат важными объектами в обеспечении сверхсинтеза целевого продукта.

Среди тысяч энзимов, присущих микроорганизмам, одни, на­пример ферменты гликолиза, синтезируются постоянно и их обра­зование не зависит от состава питательной среды. Такие ферменты называют конститутивными. Другие энзимы, адаптивные или инду- цибельные, возникают только в ответ на появление в питательной среде индукторов — субстратов или их структурных аналогов. Так, Добавление (3-галактозида — лактозы к питательной среде, на кото­рой культивируются клетки кишечной палочки Е. coli, вызывает мгновенное появление (3-галактозидазы в них, биосинтез которой ^в последующий период времени возрастает в 10000 раз. Установ­лено, что регуляция объема биосинтеза ферментов осуществляет­ся на оперонном уровне (Ф.Жакоб и Ж. Моно, 1961) путем изме­нения количества иРНК, образующихся в процессе транскрипции.

Опероном называется упорядоченная совокупность структурных генов (со знаками начала и конца) и регуляторных участков. В состав регуляторной зоны оперона входят ген-регулятор, промо­тор, усилители транскрипции (энхансеры), ослабители транскрип­ции (сайлансеры) и другие компоненты.

В процессе индукции низкомолекулярный метаболит-индуктор (например, лактоза), соединяясь с репрессорным белком (про­дукт гена-регулятора), инактивирует его и тем самым препятству­ет взаимодействию белка-репрессора с зоной оператора, что обес­печивает возможность присоединения к промотору РНК-полиме- разы и начало синтеза иРНК.

Изучение механизма регуляции новообразования аминокислот у микроорганизмов показало, что конечные продукты метаболичес­ких путей не только ингибируют активность ферментов первых ста­дий процесса, но и тормозят биосинтез ферментов последних его этапов. Таким образом, помимо аминокислот у микроорганизмов регулируется новообразование многих первичных метаболитов (пури- новых и пиримидиновых нуклеотидов, витаминов и других соедине­ний). Обнаруженный феномен был назван репрессией, а ферменты, биосинтез которых стопорится под влиянием низкомолекулярных метаболитов, переводящих репрессорный белок в активную фор­му, способную оккупировать зону первоначального связывания РНК-полимеразы (оператор), называются репрессибельными. К их числу относятся глутаминсинтетаза, триптофансинтетаза, орнитин- карбамилтрансфераза, уреаза и ряд других энзимов. Специально поставленные опыты продемонстрировали, что репрессия биосин­теза ферментов обеспечивает более грубую в сравнении с ретро- ингибированием регуляцию образования анаболических энзимов Если концентрация конечного продукта уменьшается до опреде­ленного очень низкого уровня, то происходит дерепрессия фермен­та, т. е. скорость их биосинтеза возрастает до необходимых величин Бактериальные клетки продуцируют множество низкомолеку­лярных эффекторов в ответ на изменение окружающей средь: (стресс, голодание, действие фагов и пр.). Каждый из эффекто­ров, взаимодействуя по аллостерическому механизму с опреде­ленными регуляторными белками, моделирует промоторную спе­цифичность РНК-полимеразы, запуская тем самым экспрессию определенного набора генов.

Таким образом, ведущими механизмами, обеспечивающим! экономность образования продуктов в клетках микроорганизмоь являются ретроингибирование и репрессия, базирующиеся н принципе обратной связи.

Если в питательной среде присутствуют несколько различны источников углерода, клетка микроорганизма вырабатывает фег-

Структурные гены (1ас-гены) Оператор (О)

Ген-регулятор (R)

ДНК I

Транскрипция^

рнк-

полимераза

Репрессия

Активный репресор (тетрамер) А

X Y I

цАМФ • БАК

Полицистронная иРНК ♦

Лактоза \> </ Индукция^р (индуктор)

Комплекс индуктора с неактивным репрессором

Рис. 3.2. Структура и механизм индукции и репрессии 1ас-оперона (пояс­нения в тексте):

А — в отсутствие индуктора; Б — в присутствии индуктора и при дефиците

глюкозы

менты для усвоения лишь одного, наиболее предпочтительного суб­страта. Так, когда клетки выращивают на смеси глюкозы и лакто­зы, то в первую очередь утилизируется глюкоза. После полного ис­черпания глюкозы происходит экспрессия ферментов метаболизма лактозы (экспрессия структурных генов лактозного оперона). Это явление получило название катаболитной репрессии, так как ранее полагали, что причина его состоит в подавлении биосинтеза фер­ментов обмена лактозы продуктами катаболизма глюкозы.

_ноМ питании. Чем ближе обе величины, тем выше качество белка. 5епки яйца и молока обладают высокой пищевой ценностью и используются в качестве эталона при оценке других белков. Мно- _гне белки растительного происхождения характеризуются дефи­цитом некоторых незаменимых аминокислот. Так, белки пшени­цы и риса обеднены лизином и треонином, а белки кукурузы — пизином и триптофаном.

Введение синтетических незаменимых аминокислот в кормо­вые концентраты позволяет балансировать корма сельскохозяй­ственных животных по уровню белка. При добавлении 2 —4 дефи­цитных аминокислот к 1 т комбикорма общий расход кормов уменьшается на 15 — 20 %, выход продукции увеличивается на 20 %. Добавление к кормам аминокислот способствует переводу живот­новодства на промышленную основу. Данные о потребности не­которых сельскохозяйственных животных в незаменимых амино­кислотах приведены в табл. 3.3.

Таблица 3.3

Помимо применения в качестве пищевых добавок, приправ и усилителей вкуса аминокислоты используют как сырье в хими­ческой, парфюмерной и фармацевтической промышленности и при производстве ряда других веществ:

глицин — подсластитель, антиоксидант, бактериостатик; аспарагиновая кислота — усилитель вкуса, сырье для синтеза асгтартама;

глутаминовая кислота — усилитель вкуса, препарат для лече­ния психических заболеваний;

гистидин — противовоспалительное средство; метионин — пищевая и кормовая добавки; цистеин — фармацевтический препарат; треонин и триптофан — пищевые и кормовые добавки; фенилаланин — сырье для получения аспартама; лизин — пищевая и кормовая добавки, сырье для получения искусственных волокон и пленок.

В промышленных масштабах белковые аминокислоты получают:

1) гидролизом природного белоксодержащего сырья;

2) химическим синтезом;

3) микробиологическим синтезом;

4) биотрансформацией предшественников аминокислот с по­мощью микроорганизмов или выделенных из них ферментов (хи­мико-микробиологический метод).

При гидролизе белоксодержащее сырье (отходы пищевой и молоч­ной промышленности) нагревают с растворами кислот или щело­чей при температуре 100 —105 °С в течение 20—48 ч. Чаще всего используют 20 %-й раствор соляной кислоты, обеспечивающий глу­бокий гидролиз белка. Кроме того, для ускорения реакции гидро­лиза белков используют иммобилизованные протеолитические фер­менты и ионообменные смолы. В ходе кислотного гидролиза белков происходят рацемизация и разрушение некоторых составляющих их аминокислот. При кислотном гидролизе полностью разрушается триптофан и достаточно значительны потери цистеина, метиони- на и тирозина (10—30%). Лучшим способом уменьшения потерь аминокислот при гидролизе является проведение его в вакууме или в атмосфере инертного газа, а также соблюдение высокого соотно­шения количества кислоты, взятой для гидролиза, и массы белка (200:1). Рациональное использование сырья при гидролизе, харак­терное для многих других биотехнологических производств, обес­печивает создание безотходных технологий и способствует оздо­ровлению окружающей среды. Ранее методом гидролиза получали аминокислоты исключительно для фармацевтических и научных це­лей. В последнее время сфера использования белковых гидролиза- тов существенно расширилась. Их применяют в медицине, живот­новодстве, пищевой и микробиологической промышленности.

Существенный недостаток методов химического синтеза ами­нокислот состоит в получении целевых препаратов в виде раце­мической смеси D- и L-стереоизомерных форм. Подавляющее боль­шинство природных аминокислот относится к L-ряду. D-a-ами- нокислоты обнаружены лишь в составе гликопротеинов клеточ­ных стенок бактерий, антибиотиков и некоторых токсинов. Про­ницаемость L-аминокислот в клетке в 500 раз превышает таковук: ее антипода. Стереоспецифичны также транспорт и метаболиз\ аминокислот. Исключением в этом отношении является лишь ме­тионин, метаболизм которого нестереоизбирателен, благодаря чем^л данная аминокислота получается преимущественно путем хими­ческого синтеза. Разделение рацематов других аминокислот — до­рогая и чрезвычайно трудоемкая процедура.

Наиболее перспективен и экономически выгоден микробиоло­гический синтез аминокислот. Более 60 % всех производимых в нь стоящее время промышленностью высокоочищенных препаратов белковых аминокислот получают именно этим способом, главно- преимущество которого в сравнении с методами химического сиг- теза состоит в возможности получения L-аминокислот на основ возобновляемого сырья.

В последние годы при производстве аминокислот все шире ис­пользуют биотрансформацию предшественников аминокислот, особенно с помощью иммобилизованных ферментов или клеток микроорганизмов, предварительно получаемых химическим путем.

Промышленное производство аминокислот стало возможным после открытия способности у некоторых микроорганизмов вы­делять в культуральную среду значительные количества какой-либо одной аминокислоты (С. Киносита, 1955). При этом было подме­чено, что большинство из нескольких тысяч проанализированных диких штаммов микроорганизмов продуцировали аминокислоты _во внешнюю среду, но в очень незначительных количествах. Не зафиксировано никакой связи между таксономическим положе­нием микроорганизма и способностью к продуцированию той или иной аминокислоты. Так, среди возможных продуцентов глутами- новой кислоты отмечены организмы, из которых 30 % — дрожжи, 30% — стрептомицеты, 20% — бактерии и 10% — микроскопи­ческие грибы. И лишь один из обследованных штаммов микроорга­низмов — Corynebacterium glutamicum был способен к сверхсинтезу глутамата. Этот штамм использовали при организации первого в мире крупномасштабного производства глутаминовой кислоты микробиологическим методом в Токио (1956). В России изыскания в области промышленного синтеза аминокислот были начаты в 50-х годах прошлого столетия по инициативе акад. А. А. Александрова.

Перспективные штаммы продуцентов постоянно улучшают по­средством селекции мутантов с измененной генетической про­граммой и регуляторными свойствами. Распространенные объек­ты селекции продуцентов — микроорганизмы, относящиеся к родам Brevibacterium, Micrococcus, Corynebacterium, Arthrobacter (табл. 3.4).

Разработка технологической схемы получения отдельной ами­нокислоты полностью базируется на знании путей и механизмов регуляции биосинтеза конкретной аминокислоты. Необходимого дисбаланса метаболизма, обеспечивающего сверхсинтез целевого продукта, добиваются путем строго контролируемых изменений состава и условий среды.

Микробиологические методы производства аминокислот

Производство лизина. По содержанию лизина наименее сбаланси­рованы белки злаковых культур, у которых его дефицит составляет от 20 до 50 %. На территории России недостаток лизина в кормах не может быть восполнен за счет сои, поэтому в нашей стране произ­водство этой аминокислоты было организовано первым. Для удовле­творения потребностей животноводства в лизине крупнотоннаж­ное производство налажено в Испании, Франции, Японии и США.

В клетках микроорганизмов лизин синтезируется из аспараги- новой кислоты и служит конечным продуктом разветвленного ме­таболического пути биосинтеза, общего для трех аминокислот — лизина, метионина и треонина (рис. 3.3).

Таким образом, в процессе новообразования аминокислот из об­щего предшественника одновременно с лизином возникают две дру­гие аминокислоты — метионин и треонин. В этом случае эффекта накопления в среде всего одной целевой аминокислоты добиваются путем блокирования процессов, ведущих к синтезу побочных амино­кислот, возникающих в связи с разветвлением метаболического путк

Образование лизина в клетке бактерии находится под строги\ метаболическим контролем. У типичных продуцентов L-лизина — Brevibacterium flavum и Corynebacterium glutamicum — фермент ас- партаткиназа, открывающий метаболический путь, является алло- стерическим белком, чувствительным к ингибированию по прин­ципу обратной связи при совместном и согласованном действие побочных продуктов L-треонина и L-лизина. При накоплении тре онина и лизина в избыточной концентрации ингибируется аспаг- таткиназа и их синтез останавливается, при пониженной концен­трации любой из двух аминокислот процесс активизируется.

Чтобы добиться образования лизина в больших количества: получают мутанты двух типов. У мутантов первого типа не синтез!"

Аспартат

+ АТФ | Аспартаткиназа Фосфоаспартат

Полуальдегид аспартата

\

Дигидропиколиновая кислота

а,5-Диаминопиме- ли новая кислота

Лизин

Метионин

Рис. 3.3. Схема биосинтеза лизина, метионина и треонина в клетках Corynebacterium glutamicum и Brevibacterium flavum: —»• — ингибирование по принципу обратной связи

руется или не функционирует гомосериндегидрогеназа, в результа­те чего блокируется синтез метионина и треонина. Такие мутанты являются ауксотрофами по гомосерину или треонину (метионину); внутриклеточная концентрация треонина у них существенно сни­жена, что снимает блокаду с аспартаткиназы. Поэтому при выра­щивании мутантных штаммов в среде, где присутствуют лимити­рующие концентрации метионина и треонина, они способны об­разовывать избыточные количества лизина. Мутанты второго типа дефектны по структурному гену, детерминирующему конформа- цию аспартаткиназы. В итоге фермент теряет чувствительность к высоким концентрациям аллостерического ингибитора — лизина.

Важный фактор, обеспечивающий в культуральной среде вы­сокие концентрации аминокислоты, синтезированной внутри клетки, — проницаемость клеточных мембран. Проницаемость кле­точной мембраны увеличивают либо с помощью мутаций, либо путем изменения состава питательной среды. В последнем случае в культуральной среде создают дефицит биотина (1 — 5 мкл/л), до­бавляют пенициллин (2 — 4 мкг/л), детергенты (твин-40 и твин- 60) или производные высших жирных кислот (пальмитаты, стеа- Раты). Биотин контролирует содержание в клеточной мембране фосфолипидов, а пенициллин нарушает биосинтез клеточных сте­нок бактерий, что повышает выделение аминокислот в среду.

Для культивирования штаммов микроорганизмов при произ­водстве аминокислот как источники углерода наиболее доступны Углеводы — глюкоза, сахароза и реже фруктоза и мальтоза. Для снижения стоимости питательной среды в качестве источников
углерода используют вторичное сырье: свекловичную мелассу, молочную сыворотку, гидролизаты крахмала, сульфитные щело­ка. Технология этого процесса совершенствуется в направлении разработки дешевых синтетических питательных сред на основе уксусной кислоты (до 1,5%), пропионовой кислоты, метанола, этанола (до 1 %) и н-парафинов. В качестве источников азота при­меняют мочевину и соли аммония (сульфаты и фосфаты). Для ус­пешного развития микроорганизмы нуждаются в стимуляторах роста, в качестве которых выступают экстракты кукурузы, дрож­жей и солодовых ростков, гидролизаты отрубей и дрожжей, вита­мины группы В. Кроме того, в питательную среду добавляют не­обходимые для жизнедеятельности макро- и микроэлементы (Р, Са, Mg, Мп, Fe и др.). На процесс биосинтеза аминокислот суще­ственное влияние оказывает снабжение воздухом, при этом сте­пень аэрации индивидуальна для производства каждой конкрет­ной аминокислоты. Стерильный воздух подается специальными тур­бинными мешалками (рис. 3.4). Опыты показали, что лизин появ­ляется в культуральной среде начиная с середины экспоненци­альной фазы роста культуры клеток микроорганизма и достигает максимума к ее концу. Поэтому на первой стадии технологического процесса формируют биомассу продуцента, которую выращивают в специальных посевных аппаратах в течение суток (рН 7,0 — 7,2; температура 28 — 30 °С), а затем подают в производственный фер­ментер, заполненный питательной средой. Лизин начинает посту­пать в культуральную жидкость через 25 — 30 ч после начала фермен­тации. По завершении процесса ферментации (через 55 — 72 ч) жидкую фазу отделяют от культуры клеток микроорганизма филь­трованием и используют для выделения из нее лизина.

Высокоочищенные препараты лизина получают после фрак­ционирования фильтрата культуральной жидкости методом ионо­обменной хроматографии на катеоните. С этой целью лизин пере­водят в форму катиона:

H₃N—СН— СООН I

(СН₂)₄

I

NH₃

Для данного процесса фильтрат обрабатывают соляной кисло­той до рН 1,6—2,0 (рН < рК,). Обладая двумя положительно заря­женными ионогенными группировками, лизин прочно сорбирует­ся на смоле и элюируется с нее в виде индивидуального соедине­ния 0,5 — 5 %-м раствором гидроксида аммония после выхода всех других катионов. Элюат концентрируют в вакууме при температуре 60 °С, переводят в форму монохлоргидрата, после чего высушива­ют и дополнительно чистят с помощью перекристаллизации. В ре-

Рис. 3.4. Технологическая схема получения кормовых препаратов лизина (по B.C.Шевелухе и др., 1998): 1 — подача свекловичной мелассы; 2 — водная суспензия кукурузного экстракта и питательных солей; 3 — нагревательная колонка; 4, 5 — теплообменники; 6 — посевные аппараты; 7 — подача посевного материала; 8 — система фильтров для очистки и стерилизации воздуха; 9 — ферментер; 10 — фильтры для очистки отходящих газов; 11 — получение монохлоридгидрата лизина; 12 — подача соля­ной кислоты; 13, 14 — выход и подогрев монохлоридгидрата лизина; 15 — выпа- ривательная установка; 16 — сборник ЖКЛ; 17 — смешивание ЖКЛ с наполни­телем; 18 — распылитель; 19— подача горячего воздуха; 20— очиститель воздуха; 21 — отделение сухого препарата лизина от воздуха; 22 — приемник ККЛ

зультате получают препараты кристаллического лизина 97 — 98 %-й чистоты, которые используют для повышения питательной цен­ности пищевых продуктов и в медицинской промышленности.

Кроме высокоочищенных препаратов лизина получают иные виды его товарной формы: жидкий концентрат лизина (ЖКЛ), сухой кормовой концентрат лизина (ККЛ) и высококонцентри­рованные кормовые препараты, характеризующиеся относитель­но меньшей степенью очистки в сравнении с первым препаратом.

Второй по значимости незаменимой аминокислотой для пита­ния человека и животных является метионин, который получают преимущественно путем химического синтеза, что экономически более выгодно в сравнении с микробиологическим способом.

Производство триптофана. Триптофан достаточно часто явля­ется лимитирующим фактором питания, так как его содержание в традиционных продуктах (рыба, молоко, кормовые дрожжи) в 3 раза ниже, чем в стандартном белке.

Подобно лизину триптофан образуется в ходе разветвленного метаболического пути, поэтому для его производства используют ауксотрофных мутантов, у которых блокированы реакции, веду­щие к синтезу фенилаланина и тирозина. Однако при выращива­нии мутантных штаммов в среде с минимальной концентрацией этих аминокислот, не вызывающей регуляторных эффектов, из­быточное накопление триптофана в среде не наблюдается, что объясняется особенностью процессов регуляции биосинтеза трип­тофана у микроорганизмов.

Наряду с другими ароматическими аминокислотами у микро­организмов (подобно большинству организмов) триптофан обра­зуется из метаболитов углеводного обмена — эритрозо-4-фосфата и фосфоенолпирувата.

Процесс новообразования ароматических аминокислот идет через шикимовую и хоризмовую кислоты. Метаболическим пред­шественником триптофана служит антраниловая кислота, кото­рая возникает из хоризмовой кислоты под действием антранилат- синтетазы. Триптофан оказывает ингибирующее действие на ант- ранилатсинтетазу, поэтому для обхода метаболического контроля синтез фермента индуцируют ступенчатым введением предше­ственника — антраниловой кислоты (0,1 — 0,3 %):

Фосфоенолпируват + Эритрозо-4-фосфат

I

5-Дигидрохинная кислота

Шикимовая кислота Хоризмовая кислота Фенилаланин

Антрани л атсинтетаза -«-