БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ 6 страница

Поверхностный метод выращивания продуцентов, предложенный И.Такамине еще в 1894 г., состоит в культивировании микроорга­низмов на поверхности увлажненных стерилизованных отрубей,« размещенных в кюветах, к которым иногда добавляют солодовые" ростки, древесные опилки, свекловичный жом. Инкубацию микроор-i ганизмов ведут в специальном термостатируемом цехе при постен янном контроле в нем температуры, влажности и подачи воздуха. \

В последние 15 лет для выращивания продуцентов ферментов; чаще используют более экономный — глубинный метод культиви-1 рования (рис. 4.1). В промышленных условиях для этих целей при^ меняют ферментеры из нержавеющей стали, снабженные при-! способлениями для перемешивания и подачи в жидкую питатель! ную среду стерильного воздуха. Сначала ферментер заполняют пи| тательной средой, автоклавируют, а затем засевают чистой куль! турой, подаваемой из специального генератора. Для предотвраще! ния инфекции в ферментере поддерживают повышенное давле>|

Воздух Рис. 4.1. Принципиальная технологическая схема глубинного культивирования микроорганизмов (по А.А.Свитцову и др., 1986):

смеситель питательной среды; 2 — стерилизатор в непрерывном режиме потока питательной среды; 3, 4 — теплообменники; 5 — посевные аппараты; б, 10, 12 — фильтры для очистки воздуха; 7 — ферментер; 8, 9 — насосы; 11 — компрессор

ние наряду с оптимальными значениями рН, температуры, ре- докс-потенциала и другими условиями культивирования.

В настоящее время наиболее прогрессивным признан проточ­ный метод культивирования микроорганизмов, который обеспе­чивает непрерывную подачу в ферментер как питательной среды, так и посевного материала. Размножение микроорганизмов и био­синтез фермента регулируют при использовании этого метода по мере поступления питательной смеси в ферментер. Такой фер­ментер представляет собой вращающийся трубкообразный реак­тор, через один конец которого в него поступает питательная среда и культура микроорганизмов, а из другого — выводятся фермен­ты, продукты жизнедеятельности и бактериальная масса. Основ­ное достоинство метода — возможность длительное время под­держивать в автоматическом режиме рост культуры микроорга­низма. Например, культура ацетонобутиловых бактерий находи­лась в таком реакторе в состоянии непрерывного размножения в течение 200 суток (И.Д.Иерусалимский с сотр., 1986).

Важнейшим фактором эффективности технологии ферментных препаратов является качество питательной среды. Основное тре­бование к качеству питательной среды состоит в полноценности ее состава, обеспечивающей рост продуцента и биосинтез целево­го фермента. Микроорганизмы нуждаются прежде всего в соеди­нениях, содержащих углерод, азот, водород и кислород. К ним относятся органические вещества, соли аммония и вода. Кроме того, в состав питательной среды должны быть включены мине­ральные соединения, содержащие Mg, Са, Р, S, Fe, К и другие макро- и микроэлементы, витамины, ростовые вещества (биотин, инозит) и пр. Питательные среды в зависимости от состава делят­ся на синтетические и комплексные. Синтетическими считают те среды, которые состоят из определенного по качественному и коли­чественному составу набора индивидуальных веществ. В комплекс­ные среды входят различные природные продукты, часто отходы пищевых производств. К их числу относятся различные жмыхи, барда спиртовых заводов, картофельная мезга, кукурузный экст­ракт, меласса, отруби и прочие продукты. Благодаря использова­нию отходов комплексные питательные среды доступны, дешевы и обеспечивают безотходность биотехнологических производств.

4.4. ТЕХНОЛОГИЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ

Выделение и очистка фермента как из культуры микроорга­низма (выращенного любым способом), так и из других природ­ных источников весьма трудоемкая и дорогостоящая процедура, поэтому, если фермент можно использовать в виде неочищенно­го препарата, его не очищают. В промышленности широко приме­няют коммерческие препараты ферментов, чистота которых со­ставляет всего 0,1 % (т.е. 99,9 % составляют примеси). К таким от­раслям относятся спиртовая, кожевенная, текстильная промыш­ленность, а также сельское хозяйство, производство бытовой хи­мии. Например, ферментный препарат, употребляемый в пивова­рении, представляет собой высушенную биомассу плесневых гри­бов. В большинстве отраслей пищевой промышленности, практи­ке научных исследований и особенно в медицине используют толь­ко очищенные препараты ферментов, частично или полностью освобожденные от балластных веществ и полностью охарактери­зованные в отношении их специфичности и физико-химических свойств. Исходным материалом для получения препаратов фер­ментов служат: биомасса продуцента, фильтрат культуральной жидкости, экстракт из культуры микроорганизма или из тканей и органов растений и животных, из которых готовят препараты раз­личной степени очистки.

Неочищенные ферментные препараты получают путем высуши­вания в мягком режиме культуры микроорганизмов вместе с остатка­ми питательной среды. Такие препараты получают и путем упарива­ния экстракта из культуры продуцента, выращенного поверхностным способом, или из фильтрата культуральной жидкости (в случае глубинного выращивания микроорганизмов). Распространен так­же метод ацетоновых порошков, состоящий в осаждении и быст­ром обезвоживании при температуре не выше -10 °С тканей или вытяжек из них, содержащих ферменты. Технические препараты ферментов представляют собой либо высушенные до порошко­образного состояния продукты, либо жидкие концентраты, обычно характеризующиеся 50 %-м содержанием сухой массы веществ.

Для успешного выделения ферментов из клеточного содержи­мого необходимо очень тонкое измельчение исходного материала вплоть до разрушения субклеточных структур: лизосом, митохон­дрий, ядер и др., которые имеют в своем составе многие индиви­дуальные ферменты. Для этого используют специальные мельни­цы и гомогенизаторы, а также ультразвук, метод попеременного замораживания и оттаивания ткани. Для высвобождения фермен­тов из мембранных структур клетки к гомогенатам добавляют не­большие количества детергентов (твин, тритон Х-100) или обра­батывают их энзимами — лизоцимом, целлюлазой, лецитиназой С. Особое внимание при выделении ферментов уделяют проведению всех операций в условиях, исключающих денатурацию белка (ней­тральные значения рН, стабилизирующие добавки в виде белков, солей и специальных соединений).

Пример, иллюстрирующий получение частично очищенного пре­парата (3-галактозидазы из мутанта Е. coli, представлен на рис. 4.2. Схема очистки включает отделение клеток микроорганизма по

Рис. 4.2. Технологическая схема непрерывного получения Р-галактози- дазы из клеток Е. coli ML308 (по P.P.Gray et al., 1972): 1 — стерилизатор среды; 2— ферментер; 3, 7 — центрифуги; 4 — гомогенизатор; 5 — теплообменник; 6 — смесительные камеры; 8 — ротационный вакуум-фильтр

выходе их из ферментера от культуральной жидкости посредством центрифугирования и последующее разрушение клеток в гомоге­низаторе высокого давления. Для освобождения белков от нуклеи­новых кислот полученный гомогенат обрабатывают сульфатом марганца до конечной концентрации этой соли в смеси, равной 0,05 М. Осадок нуклеиновых кислот отделяется с помощью рота­ционной вакуум-фильтрации, а в образовавшийся фильтрат до­бавляют сульфат аммония до 45 % от его насыщения. Возникший осадок белков, содержащий |3-галактозидазу, собирают с помо­щью центрифугирования или вакуум-фильтрации. Вся процедура очистки энзима от момента подачи бактерий в систему до момен­та получения осадка (3-галактозидазы занимает всего 1 ч.

В зависимости от свойств выделяемого фермента и сопутствую­щих ему балластных веществ при получении очищенных препара­тов ферментов комбинируют различные приемы и методы (рис. 4.3), такие, как термическое фракционирование, осаждение органи­ческими растворителями, солями и тяжелыми металлами, фильт­рация на молекулярных ситах, ионообменная хроматография, элек­трофорез, изоэлектрофокусирование.

На заключительных этапах очистки часто используют аффин­ную хроматографию (биоспецифическая хроматография, хромато­графия по сродству), которая основана на способности фермен­тов избирательно связывать те или иные лиганды — субстраты,

Фильтрование Концентрирование Осаждение

Вспомогательный Ацетон, спирт,

фильтрующий (NH₄)₂S0₄

материал

Вакуумный концентратор

Рост микроорганизмов

Вода

Поверхностная [культура

-| Экстрактор

Вспомогательный фильтрующий, материал | f)*|

Емкостный |биореактор

Инертные г ингредиенты J>

Смеситель

\ I

L_J__ I

Центрифуга

Лотковая сушилка

I Распылительная _ сушилка

Шаровая мельница или молотковая дробилка

Электрофорез, хроматография

Сушилка

Сухой неочи- щенный фермент

Разбавленный раствор очищен-1 ного фермента

Концентрирован­ный раствор очищенного фермента

Фракционированный фермент (для специ­альных целей)

Стандартизо­ванный фермент (сухой)

Рис. 4.3. Схема получения ферментных препаратов из культур микроорганизмов (по Дж. Бейли, Д. Оллис, 1989)

коферменты, конкурентные ингибиторы, аллостерические эффек­торы и т.п. Такое связывание весьма специфично (Кх Ю^-4 М), что позволяет выделить тот или иной энзим из множества других бел­ков. Например, из желудочного сока человека методом одноэтап- ной аффинной хроматографии выделена кислая липаза, исполь­зующаяся в заместительной терапии при заболеваниях печени.

Для синтеза аффинного сорбента, соответствующего специфич­ности данного фермента, лиганд (субстрат или его аналог) при­соединяют к инертной матрице (макропористые гидрофильные гели, синтетические полимеры, неорганические носители). Для уменьшения пространственных трудностей при взаимодействии фермента с матрицей лиганд присоединяют к носителю через про­межуточное звено (вставку, ножку, спейсер). Присоединение ли- гандов к поперечносшитой агарозе — сефарозе обычно проводят, активируя ее бромцианом (см. с. 91). Связывание с сефарозой, ак­тивированной бромцианом, л-амино-бензилянтарной кислотой, используемой в качестве лиганда, обеспечивает взаимодействие сорбента с каталитическим центром только карбоксипептидаз бла­годаря сходству лиганда с субстратами карбоксипептидазы:

—со—NH-CH-COOH НО-СО-СН-СН-СООН Матрица—О—С—NH II О С-концевой остаток Аффинный сорбент с лигандом. фенилаланина в субстрате Бензилянтарная кислота изостерична карбоксипептидазы структуре остатка фенилаланина

Сорбенты, содержащие цибакрон голубой и некоторые другие красители антрахинонового ряда, используют для аффинной хромато­графии НАД-зависимых дегидрогеназ, а носители, имеющие цикло- пептидный антибиотик грамицидин, — для протеолитических фер­ментов:

Афинный сорбент, содержащий антрахиноновый краситель

В процессе выделения повышается доля фермента в массе тоталь­ных белков, т.е. увеличивается его удельная активность. В табл. 4.2 представлены данные, характеризующие процедуру очистки от сопутствующих ферментов и балластных белков глюкоамилазы из культуры Endomycopsis ssp. 20-9. Анализ таблицы показывает, что чистота глюкоамилазы в препарате возросла в 37 раз и в получен­ном препарате отсутствует активность двух ферментов углеводно­го обмена — гликозилтрансферазы и а-амилазы.

В производственных условиях активность получаемого фермент­ного препарата оценивается количеством субстрата, преобразо­ванного 1 мг (1кг) препарата при оптимальных условиях за 1 мин, и измеряется в Е/мг, моль/мг или каталах/кг белка.

Очищенные ферментные препараты хранят при низкой темпе­ратуре (до -80 °С). Для стабилизации ферментов в их препараты добавляют коферменты и субстраты. Ферментные препараты для промышленного применения стабилизируют, добавляя глицерин, моносахариды, дисахариды (глюкоза, сахароза, лактоза), HS-co- единения (цистеин, глутатион, меркаптоэтанол, дитиотреитол и др.), отдельные аминокислоты, желатину и другие белки-напол­нители.

Существенно, что из 2003 включенных в список известных в настоящее время ферментов более 1500 выделено и в той или иной степени очищено; это служит не только базой для изучения физи­ко-химических основ ферментативного катализа, но и фундамен­том для совершенствования химического производства и промыш­ленности.

4.5. ИНЖЕНЕРНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ, ЕЕ ЗАДАЧИ

Развитие прикладной энзимологии долгое время сдерживалось дороговизной чистых ферментных препаратов, неустойчивостью их при хранении и невозможностью многократного использова­ния. Принципиально новые перспективы открылись перед при­кладной энзимологией в 60-е годы XX в. в результате появления на стыке химии и биологии новой отрасли — инженерной энзи­мологии. Ее задачи заключаются в развитии прогрессивных мето­дов выделения ферментов, их стабилизации и иммобилизации; конструировании катализаторов с нужными свойствами и разра­ботке научных основ их применения.

В частности, методами белковой инженерии, сущность кото­рых состоит в изменении первичной структуры природной моле­кулы фермента посредством химической модификации самого; энзима или его гена, удается принципиально трансформировать структуру активного центра и его функцию, модулировать суб­стратную специфичность и физико-химические свойства фермен­та. Так, замена остатка глутамина-102 в молекуле лактатдегидро- геназы на аргинин превратила фермент в высокоактивную малат- дегидрогеназу. Описанным способом получены термостабильные формы лизоцима Т-4 и субтилизина (каталитическая константа субтилизина изменена в 100 раз), созданы гибридные формы фер­ментной системы, ценной в иммуноферментном анализе, сочета­ющие в себе свойства Р-галактозидазы и р-галактокиназы.

Многие проблемы технологии синтеза органических соедине­ний, пищевой и медицинской промышленности, мониторинга че­ловека и окружающей среды, защиты окружающей среды, энер­гетики не могут быть решены без использования методов совре­менной инженерной энзимологии.

Важным этапом развития инженерной энзимологии стала раз­работка способов получения и использования иммобилизованных ферментов.

4.6. ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ ФЕРМЕНТЫ

Иммобилизованными ферментами называются ферменты, ис­кусственно связанные с нерастворимым носителем, но сохраня­ющие свои каталитические свойства.

Еще в 1916 г. Дж. Нельсон и Е.Гриффин показали, что сахаро­за, сорбированная на угле, сохраняла свою каталитическую ак­тивность, но лишь в 1953 г. Н. Грубхофер и Д. Шлейт впервые осу­ществили ковалентные связывания амилазы, пепсина, РНКазы и карбоксипептидазы с нерастворимым носителем.

В 1971 г. на первой конференции по инженерной энзимологии был узаконен термин «иммобилизованные ферменты». Однако в понятие «иммобилизация» в настоящее время вкладывают более широкий смысл, чем связывание на нерастворимом носителе, а именно — полное или частичное ограничение свободы движения белковых молекул.

Иммобилизованные ферменты имеют ряд преимуществ в сравнении со свободными молекулами. Прежде всего такие фер­менты, представляя собой гетерогенные катализаторы, легко от­деляются от реакционной среды, могут использоваться многократ­но и обеспечивают непрерывность каталитического процесса. Кроме того, иммобилизация ведет к изменению свойств фермента: суб­стратной специфичности, устойчивости, зависимости активнос­ти от параметров среды. Иммобилизованные ферменты долговеч­ны и в тысячи и десятки тысяч раз стабильнее свободных энзимов. Так, происходящая при температуре 65 °С термоинактивация лак- татдегидрогеназы, иммобилизованной в 60%-м полиакриламид- ном геле, замедлена в 3600 раз по сравнению с нативным фер­ментом. Все перечисленное обеспечивает высокую экономичность, эффективность и конкурентоспособность технологий, использу­ющих иммобилизованные ферменты.

4.6.1. Носители для иммобилизации ферментов

По Дж. Порату (1974), идеальные материалы, используемые для иммобилизации ферментов, должны обладать следующими основ­ными свойствами: нерастворимостью; высокой химической и био­логической стойкостью; значительной гидрофильностью; доста­точной проницаемостью как для ферментов, так и для кофермен- тов, субстратов и продуктов реакции; способностью носителя легко активироваться (переходить в реакционноспособную форму).

Естественно, ни один из используемых в настоящее время в качестве носителя материал не отвечает полностью перечислен­ным требованиям. Тем не менее существует широкий набор носи­телей, пригодных для иммобилизации определенных энзимов в конкретных условиях.

В зависимости от природы носители делятся на органические и неорганические материалы.

Органические полимерные носители. Иммобилизация многих ферментов осуществляется на полимерных носителях органичес­кой природы. Существующие органические полимерные носите­ли можно разделить на два класса: природные и синтетические полимерные носители. В свою очередь, каждый из классов орга­нических полимерных носителей подразделяется на группы в за­висимости от их строения. Среди природных полимеров выделя­ют белковые, полисахаридные и липидные носители, а среди синтетических — полиметиленовые, полиамидные и полиэфир­ные.

К преимуществам природных носителей следует отнести их доступность, полифункциональность и гидрофильность, а к недо­статкам — биодеградируемость и достаточно высокую стоимость.

Из полисахаридов для иммобилизации наиболее часто исполь­зуют целлюлозу, декстран, агарозу и их производные. Для прида­ния химической устойчивости линейные цепи целлюлозы и дек- страна поперечно сшивают эпихлоргидрином. В полученные сет­чатые структуры довольно легко вводят различные ионогенные группировки. Химической модификацией крахмала сшивающими агентами (формальдегид, глиоксаль, глутаровый альдегид) син­тезирован новый носитель — губчатый крахмал, обладающий по­вышенной устойчивостью к гликозидазам.

Из природных аминосахаридов в качестве носителей для им­мобилизации применяют хитин, который в значительных коли­чествах накапливается в виде отходов в процессе промышленной переработки крабов и креветок. Хитин химически стоек и имеет хорошо выраженную пористую структуру.

Среди белков практическое применение в качестве носителей нашли структурные протеины, такие, как кератин, фиброин, коллаген и продукт переработки коллагена — желатина. Эти белки широко распространены в природе, поэтому доступны в значи­тельных количествах, дешевы и имеют большое число функцио­нальных групп для связывания фермента. Белки способны к био­деградации, что очень важно при конструировании иммобилизо­ванных ферментов для медицинских целей. К недостаткам белков как носителей в этом случае следует отнести их высокую иммуно- генность.

Синтетические полимерные носители. Благодаря разнообразию и доступности материалы этой группы широко используются как носители для иммобилизации. К ним относятся полимеры на ос­нове стирола, акриловой кислоты, поливинилового спирта; по­лиамидные и полиуретановые полимеры. Большинство синтети­ческих полимерных носителей обладают механической прочнос­тью, а при образовании обеспечивают возможность варьирования в широких пределах величины пор, введения различных функци­ональных групп. Некоторые синтетические полимеры могут быть произведены в различных физических формах (трубы, волокна, гранулы). Все эти свойства полезны для разных способов иммоби­лизации ферментов.

Носители неорганической природы. В качестве носителей наи­более часто применяют материалы из стекла, глины, керамики, графитовой сажи, силикагеля, а также силохромы, оксиды ме­таллов. Их можно подвергать химической модификации, для чего носители покрывают пленкой оксидов алюминия, титана, гаф­ния, циркония или обрабатывают органическими полимерами. Основное преимущество неорганических носителей — легкость регенерации. Подобно синтетическим полимерам неорганическим носителям можно придать любую форму и получать их с любой степенью пористости.

Итак, к настоящему времени создано огромное число разнооб­разных носителей для иммобилизации ферментов. Однако для каж­дого индивидуального фермента, используемого в конкретном тех­нологическом процессе, необходимо подбирать оптимальные ва­рианты как носителя, так и условий и способов иммобилизации.

4.6.2. Методы иммобилизации ферментов

Существуют два принципиально различных метода иммобили­зации ферментов: без возникновения ковалентных связей между ферментом и носителем (физические методы иммобилизации) и с образованием ковалентной связи между ними (химические ме­тоды иммобилизации). Каждый из этих методов осуществляется разными способами (рис. 4.4).

К недостаткам адсорбционного метода следует отнести невы­сокую прочность связывания фермента с носителем. При измене­нии условий иммобилизации могут происходить десорбция фер­мента, его потеря и загрязнение продуктов реакции. Существенно повысить прочность связывания фермента с носителем может предварительная его модификация (обработка ионами металлов, полифункциональными агентами — полимерами, белками, гид­рофобными соединениями, монослоем липида и пр.). Иногда, наоборот, модификации подвергается молекула исходного фер­мента, однако зачастую это ведет к снижению его активности.

Иммобилизация ферментов путем включения в гель. Способ иммобилизации ферментов путем включения в трехмерную струк­туру полимерного геля широко распространен благодаря своей простоте и уникальности. Метод применим для иммобилизации не только индивидуальных ферментов, но и мультиэнзимных ком­плексов и даже интактных клеток. Иммобилизацию ферментов в геле осуществляют двумя способами. В первом случае фермент вво­дят в водный раствор мономера, а затем проводят полимериза­цию, в результате которой возникает пространственная структура полимерного геля с включенными в его ячейки молекулами фер­мента. Во втором случае фермент вносят в раствор уже готового полимера, который впоследствии переводят в гелеобразное со­стояние. Для первого варианта используют гели полиакриламида, поливинилового спирта, поливинилпирролидона, силикагеля, для второго — гели крахмала, агар-агара, каррагинана, агарозы, фос­фата кальция.

Иммобилизация ферментов в гелях обеспечивает равномерное распределение энзима в объеме носителя. Большинство гелевых матриц обладает высокой механической, химической, тепловой и биологической стойкостью и обеспечивает возможность много­кратного использования фермента, включенного в его структуру. Однако метод непригоден для иммобилизации ферментов, дей­ствующих на водонерастворимые субстраты.

Иммобилизация ферментов в полупроницаемые структуры. Сущ­ность этого способа иммобилизации заключается в отделении вод­ного раствора фермента от водного раствора субстрата с помо­щью полупроницаемой мембраны, пропускающей низкомолеку­лярные молекулы субстратов и кофакторов, но задерживающей большие молекулы фермента. Разработано несколько модифика­ций этого метода, из которых интерес представляет микрокапсу- лирование и включение ферментов в липосомы.

Первый способ предложен Т.Чангом в 1964 г. и состоит в том, что водный раствор фермента включается внутрь замкнутой мик­рокапсулы, стенки которой образованы полупроницаемым поли­мером. Один из механизмов возникновения мембраны на поверх­ности водных микрокапсул фермента заключается в реакции меж­фазной поликонденсации двух соединений, одно из которых ра-] створено в водной, а другое — в органической фазе. Примером может служить образование на поверхности раздела фаз микро­капсулы, получаемой путем поликонденсации гексаметилендиа- мина-1,6 (водная фаза) и галогенангидрида себациновой кисло­ты (органическая фаза):

H₂N-(CH₂)₆-NH₂ + СЮС-(СН₂)₈-СОС1

—ны

—- -HN-(CH₂)₆-NH - СО—(СН₂)₈—СО-

Размер получаемых капсул составляет десятки или сотни мик­рометров, а толщина мембраны — сотые доли микрометра.

Достоинства метода микрокапсулирования — простота, уни­версальность, возможность многократного использования натив- ного фермента (фермент может быть отделен от непрореагировав-; шего субстрата и продуктов реакции процедурой простого фильт-, рования). Особенно существенно, что методом микрокапсулиро­вания могут быть иммобилизованы не только индивидуальные ферменты, но и мультиэнзимные комплексы, целые клетки и отдельные фрагменты клеток. К недостаткам метода следует отне­сти невозможность инкапсулированных ферментов осуществлять превращения высокомолекулярных субстратов.

Близким к инкапсулированию методом иммобилизации мож­но считать включение водных растворов ферментов в липосомы, представляющие собой сферические или ламеллярные системы двойных липидных бислоев. Впервые данный способ был приме­нен для иммобилизации ферментов Дж. Вайсманом и Дж. Сессом в 1970 г. Для получения липосом из растворов липида (чаще всего лецитина) упаривают органический растворитель. Оставшуюся тонкую пленку липидов диспергируют в водном растворе, содер­жащем фермент. В процессе диспергирования происходит само­сборка бислойных липидных структур липосомы, содержащий включенный раствор фермента. }