БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ 8 страница

1. Специфическое расщепление ДНК рестрикцирующими нук- леазами, что в значительной степени ускоряет выделение различи ных генов и манипуляции с ними.

2. Быстрое секвенирование всех нуклеотидов в очищенном фраг-, менте ДНК, позволяющее определить точные границы гена и ко? дируемую им аминокислотную последовательность полипептида;,

3. Гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая с большой точностью выявить специфические нуклеотидные последователь! ности на основе их способности связывать комплементарные ос; нования. I

4. Клонирование ДНК, суть которого сводится к введению ДНК| фрагмента в самореплицирующийся генетический аппарат (плазмИ ду или вирус), который используют для трансформации бактери' Бактериальная клетка после трансформации способна воспрои" водить этот фрагмент во многих миллионах идентичных копий.

5. Генетическая инженерия, позволяющая получать модифиЩ рованные версии генов и затем внедрять их в клетки или органи' мы.

Технология рекомбинантных ДНК оказала существенное вс действие на всю клеточную биологию, позволяя решать такие 31

'V

дачи, как определение строения и функций не только белков, но и индивидуальных доменов, а также расшифровывать механизмы регуляции экспрессии генов, получать многие белки, участвую­щие в регуляции обменных процессов, клеточной пролиферации и развитии организма.

Расщепление ДНК в специфических участках нуклеотидных пос­ледовательностей осуществляется особыми ферментами — рест- рикцирующими нуклеазами, способными разрушить чужерод­ную ДНК. Все ферменты условно можно разделить на следующие группы:

1) используемые для получения фрагментов ДНК;

2) синтезирующие фрагменты ДНК на матрице РНК;

3) соединяющие фрагменты ДНК;

4) позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК;

5) применяемые для приготовления гибридизационных проб.

Каждый фермент, способный разрушить чужеродную ДНК,

опознает в ней специфическую последовательность из 4 —6 ну- клеотидов. Соответствующие последовательности в геноме бакте­рий замаскированы метилированием остатков с помощью метилаз.

Согласно номенклатуре, предло­женной Х.Смитом и Д.Натансоном, название рестриктазы складывается из трех букв: первая обозначает ро­довое название, две последующие — первые буквы вида. Например, фер­мент из Е. coli обозначают как Есо или из Haemophilus influenzae — Hin и т.д. Типовая или штаммовая иденти­фикация следует за родовидовой, на­пример, EcoRI или Hindll и т.д. В на­стоящее время различные фирмы вы­пускают более 100 разнообразных ферментов, опознающих различные последовательности нуклеотидов. Для каждого конкретного фермента они различаются по длине, первичной структуре и способу разрыва молеку­лы ДНК. Подавляющее большинство ферментов разрывает только двуни- тевую ДНК с образованием серии _{Рис 5л} у_частки узнавания Фрагментов, называемых рестрикци- д_{НК тремя реС}триктазами из онными (или рестриктами; с тупы- Haemophilus parainfluenzae МИ либо липкими концами (рис. 5.1). (Hpal); Escherichia coli (EcoRI)

Многие рестриктазы вносят разры- и Haemophilus influenzae вы в две цепи ДНК со смещением на (Hindlll)
несколько нуклеотидов и образованием на концах фрагменте! коротких одноцепочечных участков. Они способны образовывать комплементарные пары оснований с любым другим одноцепо- чечным участком, полученным с помощью того же фермента (лип­кие концы). Липкие концы позволяют легко соединить два любы;, фрагмента ДНК в одно целое. Полученный фрагмент ДНК (любо­го происхождения) можно встроить в очищенную ДНК плазми- ды или бактериального вируса.

Сравнение размеров фрагментов ДНК после обработки соот­ветствующего участка генома набором рестриктаз позволяет по­строить рестрикционную карту, отражающую расположение оп­ределенной последовательности нуклеотидов в данном участке Сравнением таких карт можно оценить степень гомологии межд\ отдельными генами (участками) без определения их нуклеотид ной последовательности. Рестрикционные карты важны для кло­нирования ДНК, решения эволюционных и филогенетических за­дач.

Для успешного решения задач генетической инженерии оченж важно быстро секвенировать (определить последовательность нук| леотидов) любые очищенные фрагменты ДНК. В настоящее врем$ объем информации о последовательностях ДНК столь велик, чт<| для хранения и анализа данных о фрагментах, целых геномах ней» обходимы новые технологии и компьютерная техника. «

Исходный фрагмент ДНК, меченный ³²Р по 5'-концу

P-T-G-C-A-C-T-T-G-A-A-C-G-C-A-T-G-C-T

Расщепление ДН К по остаткам (а)-,'

P-T-G-C-A-C-T-T-G-A-A-C-G-C

Р—Т—G—С—А—С—Т—Т—G—А + C-G-C-A-T-G-C-T

A-C-G-C-A-T-G-C-T

С-Т -T-G -А-А-С -G -С -А -Т -G -С -Т

Немеченые фрагменты

Электрофореграмма

Рис. 5.2. Схема получения семейства меченных по 5'-концу фрагмен ДНК в результате расщепления по определенному нуклеотиду (А)

В биотехнологии рекомбинантных ДНК обычно используют два различных метода секвенирования ДНК: химический и фермен­тативный. Оба метода чрезвычайно надежны, быстры в исполне­нии й результативны. Результаты секвенирования позволяют так­же на основе генетического кода определить аминокислотную пос­ледовательность белка в соответствии с нуклеотидной последо­вательностью в соответствующем гене. На рис. 5.2 представлена схема химического метода секвенирования ДНК Исходный фраг­мент ДНК, меченный ³²Р по 5'-концу, подвергается специфи­ческому расщеплению по определенному нуклеотиду (например, А), в результате чего образуются радиоактивные фрагменты раз­ной длины, которые разделяются по размерам при гель-электро­форезе, а радиоактивные из них выявляются с помощью радиоавто­графии.

Обычно химическая процедура расщепления ДНК выполняет­ся одновременно для четырех одинаковых проб ДНК с использо­ванием химических агентов, расщепляющих ДНК по отдельным нуклеотидам (Т, С, G и А). Полученные образцы подвергают элек­трофорезу на параллельных дорожках одного геля, и по его ре­зультатам можно определить нуклеотидную последовательность ДНК (рис. 5.3).

Энзиматический метод секвенирования основан на энзиматичес- ком введении нуклеотида, терминирующего полинуклеотидную цепь (рис. 5.4). В этом случае обычно используют дидезоксирибо- нуклеозидтрифосфаты, в которых дезоксирибоза-З'-ОН, представ­ленная в нормальных нуклеотидах, отсутствует. Такой модифици­рованный нуклеотид, внедряясь в цепь ДНК с помощью ДНК- полимеразы, блокирует присоединение следующего нуклеотида. Синтез in vitro молекулы ДНК в присутствии затравки (прайме- ра) и небольшого количества одного из таких модифицирован­ных нуклеотидов приводит к образованию фрагментов ДНК в виде «лесенки». Если для получения таких фрагментов применять мече­ную ДНК (обычно проводят четыре реакции синтеза с использо­ванием различных нуклеотидов, терминирующих цепь), а электро- форетический анализ проводить на четырех дорожках геля, то мож­но определить последовательность нуклеотидов. В настоящее вре­мя используют модифицированный метод, сводящийся к флуо­ресцентному анализу наборов фрагментов ДНК в процессе дви­жения по одной дорожке геля.

Важнейший метод получения рекомбинантных ДНК основан на способности нуклеиновых кислот быстро восстанавливать свою структуру после нагревания до 100 "С в сильно щелочной среде (рН 13). При нагревании до 100 °С комплементарные пары основа­ний разрушаются и ДНК диссоциирует на две раздельные цепи. Этот процесс назван денатурацией ДНК («плавлением»). Выдер­живание комплементарных цепей при температуре 65 °С приводит

Последовательность нуклеотидов во фрагменте ДНК Рис. 5.3. Схема электрофореграммы, полученной с помощью химическо­го метода секвенирования ДНК (первая снизу строка соответствует нук- леотиду на 5'-конце и является нуклеотидом Т на уровне первой дорожки. Для определения полной последовательности (отмечено пунктиром) про­водят анализ послойно всех дорожек

к их спариванию и восстановлению структуры двойной спирали (гибридизация, ренатурация, или «отжиг»). Это свойство ДНК широко используют в химической систематике, а также для ре­шения эволюционных и филогенетических проблем.

Скорость восстановления (ренатурации) двойной спирали за­висит от вероятности столкновения двух комплементарных нук- леотидных последовательностей и их концентрации в растворе. Ско­рость реакции гибридизации можно использовать для определе­ния концентрации любых последовательностей РНК или ДНК в смеси, содержащей и другие фрагменты нуклеиновых кислот. Для этого необходимо иметь чистый одноцепочечный фрагмент ДНК, комплементарный к тому фрагменту, который надлежит выявить. Обычно фрагмент ДНК, полученный клонированием либо хими­ческим путем, метят по ³²Р в целях прослеживания включения фрагмента в состав дуплексов при гибридизации. Одноцепочеч-

А

Флуоресцентно-меченная затравка для ДНК-полимеразы

Смесь дНТФ с добавлением небольшого количества дидНТФ

5'У///////Л GCTACCTGCATGGA

з'ШЯгггШгЕс CGATGGACGTACCTCTGAAGCG^

Одноцепочечная ДНК, нуклеотидную последовательность которой надо определить

Включение дидНТФ блокирует дальнейший рост молекулы ДНК

gctacctgcatgga Y/МШЛ GCTA

УМ////М ГгГТАГГТГ.ГА

Смесь флуоресцирующих молекул комплементарной ДНК различной длины, оканчивающихся на А

СИЗ

Рис. 5.4. Схема энзиматического метода секвенирования нуклеиновых кис­лот, основанного на энзиматическом введении нуклеотида, терминирую­щего цепь:

щщш

?

Смесь молекул Смесь молекул, Смесь молекул, Смесь молекул,

различной длины, оканчива- оканчива- оканчива-

оканчивающихся на А ющихся на Т ющихся на С ющихся на G

в очень низкой концентрации и тем самым определять, какое ко­личество копий последовательности ДНК, комплементарной ДНК- зонду, присутствует в геноме клетки.

ДНК-зонды применяют для поиска родственных генов; в реакциях гибридизации с РНК — для выявления экспрессии дан­ного гена в различных клетках. Для выявления молекул нуклеино­вых кислот, комплементарных всему зонду (или его участку), ДНК- зонды часто сочетают с методом гель-электрофореза, что позво­ляет получать информацию о размерах гибридизируемых молекул ДНК. Эффективное использование современных приборов, спо­собных автоматически синтезировать любые нуклеотидные пос­ледовательности за короткий промежуток времени, дало возмож­ность перестраивать гены, что представляет собой один из важ­ных аспектов генной инженерии. Обмен генами, а также введение в клетку гена другого вида организма осуществляют посредством генетической рекомбинации in vitro. Этот подход был разработан на бактериях, в частности на Е. coli. Он основан на важном свойстве ДНК — способности к перестройкам, изменяющим комбинацию генов в геноме и их экспрессию. Такая уникальная способность ДНК позволяет приспосабливаться данному виду к изменяющей­ся среде. Генетическую рекомбинацию подразделяют на два боль­ших класса: общую рекомбинацию и сайт-специфическую реком­бинацию. В процессе общей рекомбинации генетический обмен в ДНК происходит между гомологичными нуклеотидными после­довательностями, например между двумя копиями одной и той же хромосомы в процессе мейоза (кроссинговера), или при скре­щивании и перегруппировке генов у бактерий.

В процессе сайт-специфической рекомбинации в обмен вступа­ют короткие специфические нуклеотидные последовательности одной и той же или обеих спиралей ДНК, распознаваемые осо­бым сайт-специфическим ферментом, что приводит к трансфор­мации распределения нуклеотидных последовательностей в гено­ме. Любые комплементарные взаимодействия между двумя гомо­логичными спиралями ДНК возможны лишь тогда, когда в одной из двух цепей происходит разрыв. К числу факторов, вызывающих такие одноцепочечные разрывы, относят: химические агенты, не­которые виды излучения, специфические белки. Например, у Е. coli обнаружен белок rec BCD, который вызывает в молекулах ДНК одноцепочечные разрывы. Белок rec BCD представляет собой ДНК- зависимую АТРазу, которая действует как ДНК-хеликаза, пере­мещающаяся по спирали ДНК и вызывающая ее расплетение. Под влиянием этого белка, обладающего нуклеазной и хеликазной ак­тивностью, на двойной спирали ДНК возникает разрыв с образо­ванием одноцепочечного участка «ус» (whisker) (рис. 5.5).

Белок rec BCD присоединяется к двойной спирали ДНК с од­ного конца (5') и со скоростью около 300 нуклеотидов в секунду
движется вдоль спирали ДНК за счет гидролиза АТР. Одновремен­но с белком движется и возникшая петля ДНК. Когда петля на спирали достигает участка, называемого сайтом узнавания (recogni­tion site), одна из цепей разрывается с освобождением небольшо­го одноцепочечного участка «ус». Возникший «ус» инициирует даль­нейшую генетическую рекомбинацию.

Белок rec BCD Рис. 5.5. Схема процесса общей рекомбинации с участием белка rec BCD у E.coli: А — двойная спираль ДНК; Б — присоединение к двойной спирали белка rec BCD с последующим его перемещением; В — возникновение разрыва в сайте узнавания; Г — образование одноцепочечного участка «ус»

В процессе общей генетической рекомбинации центральная роль отводится комплементарным взаимодействиям нуклеотид- ных последовательностей. Кроме того, этот процесс требует уча­стия особого белка гесА с Mr, равной 38 кДа. Белок гесА прочно связывается в виде крупных кластеров с одиночными цепями ДНК, одновременно удерживая и двойную спираль. За счет двух сайтов данный белок имеет еще один участок — для связывания и гидролиза АТР, т.е. он представляет собой ДНК-зависимую АТРазу. Благодаря особенностям белка гесА осуществляются од-

Рис. 5.6. Схема начального одноцепочечного обмена между двумя гомо­логичными двойными спиралями ДНК в процессе общей рекомбинации

ноцепочечный обмен между двумя двойными спиралями (рис. 5. с удалением некоторого количества нуклеотидов и локальный ре синтез ДНК.

Разрыв в одной из цепей ДНК высвобождает эту цепь, и он внедряется во вторую спираль, образуя короткий спаренный учас

ток. После начального обмена roMi логичные нуклеотидные последовг тельности двух взаимодействующв спиралей устанавливаются в строго соответствии одна с другой, в связс с чем происходит расширение обл? сти спаривания и быстрый обме между спиралями. Для этого процеа, разные организмы используют нес динаковые механизмы, большинств из которых включает в качестве прс межуточного этапа обмен с перекр. щиванием цепей между двумя сш ралями ДНК (рис. 5.7).

Структура, образующаяся при оР мене с перекрещиванием цепей, сС держит две перекрещенные и две н перекрещенные цепи. Она способ? : существовать в различных изомернР

формах. Изомеризация меняет пол| жение двух пар цепей: две ранее п! рекрещивающиеся цепи становяТ( неперекрещивающимися и наобор<1 Для того чтобы восстановили^ две отдельные спирали ДНК и flj самым прекратился процесс спар вания, в каждой из двух перекрещён ных цепей должен произойти разр! (рис. 5.8).

--- AT Г Ц AATT ЦАГТЦ

ТАЦГ ТТААГТЦАГ

Сшивание | ДНК-лигаза

АТГЦ-ААТТ-ЦАГТЦ ТАЦГ-ТТАА-ГТЦАГ

-АТГЦААТТ ЦТГАГАТЦЦА ТАЦГ

ТАЦГ ТТААГАЦТЦТ АГГТАТГЦ

Фрагмент 1 Линкер Фрагмент 2

----- AT ГЦ Г Г Г Ц Ц Ц ГТ А Ц-------------

--- ТАЦГЦЦЦ Г Г ГЦА Т Г-----

Мет Тир Гли Гли Фен Лей Stop , I 11 I I м и м 11 I ,.

.ААТТ^ЦАТГТАТГГТГГЦТТТЦТГТАА

ГТАЦАТАЦЦАЦЦГАААГАЦАТТЦТАГ'^

■ EcoRI \BamHI

«Липкий» \

конец «Липкий»

конец

Один из важных этапов конструирования молекулы ДНК лигирование (или сшивание) генов с помощью фермента ДНК лигазы. Сшивание фрагментов ДНК, содержащих нужные гень осуществляют двумя основными методами: а) по «липким» кой* цам; б) с помощью искусственно достроенных «липких» концов Сшивание генов (фрагментов) ДНК по «липким» концам, т.1 взаимнокомплементарным участкам, длиной из 4—6 пар нукле< тидов, достаточно легко осуществляется ферментом ДНК-лиг^ зой с образованием ковалентной фосфодиэфирной связи меж!| соседними нуклеотидами:

--АТГЦААТТ ЦАГТЦ----------- V

ТАЦГ ТТААГТЦАГ----------- *

Сшивание | ДНК-лигаза AT Г Ц ААТТ-ЦАГТЦ

ТАЦГ-ТТАА-ГТЦАГ •

if Ее

Чаще других в генетической инженерии в качестве векторов исполь­зуют плазмиды. Плазмидами называют бактериальные репликоны (внехромосомные элементы наследственности), стабильно насле­дуемые. Они представляют собой двуцепочечные кольцевые моле­кулы ДНК с вариабельными молекулярными массами. По разме­ру они соответствуют 1 — 3 % генома бактериальной клетки. Так, молекулярная масса одной из самых мелких плазмид, найденных у Е. coli, составляет 1,5 МДа, а клетки псевдомонад содержат плаз­миды с Mr около 300 МДа, что составляет 15 % от Mr хромосом этих бактерий. Плазмиды разделяют на конъюгативные, способ­ные сами перенестись в реципиентные клетки с помощью конъю­гации, и не конъюгативные, не обладающие этим свойством. Они детерминируют разные свойства: резистентность к антибиотикам (R-плазмиды); биодеградацию (D-плазмиды) и др. Например, плаз­миды стафилококков несут гены устойчивости к пенициллину, соединениям ртути и др. Гены устойчивости к тяжелым металлам обнаружены также в составе R-плазмид Е. coli. Плазмиды могут управлять синтезом инсектицида в клетках Bacillus thuringiensis. F- плазмида Е. coli или FP-плазмиды псевдомонад являются поло­выми факторами. Плазмида pS 101 с Mr 5,8 МДа несет ген устой­чивости к тетрациклину (селективный маркер). У различных мик­роорганизмов — Е. coli, Salmonella, Bacillus, Saccharomyces обнаружены Col-плазмиды, обеспечивающие синтез разных ко- лицинов — высокоспецифических антибиотиков, подавляющих жизнедеятельность других штаммов микроорганизмов того же вида или родственных видов. Количество плазмид в клетке может коле­баться от одной до более ста. В целом чем крупнее плазмида, тем меньше количество ее копий в клетке.

Первый плазмидный вектор был получен С.Коэном (1973). Его источником была плазмида Е. coli R₆_₅ с Mr 65 кДа. Плазмида стала родоначальником серии векторов и других структур. Особое место в генетическом манипулировании занимает плазмида, от­носящаяся к группе колициногенных плазмид Е. coli. Col El реп­лицируется независимо от хромосомы и присутствует в количе­стве примерно 24 копий на клетку. Ее широко используют благо­даря селективному маркеру в качестве вектора для клонирования фрагментов про- и эукариотической ДНК в Е. coli.

Плазмида ColEl (Mr 4,2 МДа) применяется для клонирова­ния EcoRl-фрагментов. При этом интеграция чужеродного фраг­мента в участок узнавания EcoRI ведет к фенотипическому изме­нению клетки, прекращению синтеза колицина с сохранением иммунности к нему. Этот признак используют при отборе реком­бинантных трансформантов.

Плазмида pBR313 содержит уникальные участки расщеплений нескольких рестриктаз: EcoRI, Hindlll, BamHI, Sail, Xmal и Hpal. Конструируя рекомбинантную ДНК, в эти участки можно встра­
ивать фрагменты чужеродной ДНК, полученные с помощью со­ответствующих рестриктаз. На рис. 5.10 изображена схема распо­ложения генов в плазмиде pBR322. Плазмида pBR322 содержит два гена, программирующих устойчивость к двум различным ан­тибиотикам — тетрациклину (ген tet) и ампициллину (ген Ыа). В гене tet находятся уникальные участки расщепления рестриктаза- ми Hindlll, BamHI и Sail, а в гене Ыа — участок расщепления Pstl. Если разрезать плазмиду любой из рестриктаз, участок расщепле­ния которой находится в гене tet, и соединить ее методом «лип­ких» концов с чужеродным фрагментом ДНК, то в полученной рекомбинантной молекуле останется нетронутым только ген Ыа, а ген tet утрачивает свою активность, так как его целостность на­рушается вставкой. Напротив, при разрезании плазмиды рестрик- тазой Pstl и внедрении в этот участок фрагмента ДНК инактиви- руется ген Ыа, тогда как ген tet продолжает кодировать белок, обеспечивающий устойчивость Е. coli к тетрациклину. Плазмид- ные векторы в настоящее время чрезвычайно разнообразны за счет следующих свойств:

уменьшения размеров плазмиды вследствие изъятия участков, не обязательных для репликации (чем больше плазмида содержит уникальных участков узнавания для рестриктаз, тем она универ­сальнее);

EcoRI XmnI 4361 Clal 23 ACGI 2246 2246 Snal 2246 Рис. 5.10. Схема строения плазмиды pBR322

гибридизации векторов одного рода с другими векторами или природными плазмидами (например, получены гибридные векто­
ры комбинацией плазмиды и фага X (при этом вновь сконструиро­ванная рекомбинантная ДНК должна сохранить репликационные свойства исходной плазмиды);

использования новых плазмид;

применения транспозонов;

создания векторов с генетическими маркерами, позволяющи­ми вести отбор рекомбинантных клонов.

Эукариотические вирусы до сих пор нашли более скромное при­менение в качестве векторов. Практически используются только онкогенный вирус SV 40 и его производные. Все эти векторы — дефектные вирусы, не способные давать полноценные вирусные частицы в клетке хозяина. Анализируемую ДНК можно вводить и в другие репликоны, способные размножаться в клетках, напри­мер бактериофаги. Чаще всего из известных фагов в качестве век­торов применяют сконструированные производные фага X и фа­гов М13 и fd. В векторах на основе бактериофага X используется его особенность, состоящая в том, что большая часть его ДНК не участвует в размножении фага в клетке. Это позволяет вводить чужеродную ДНК в ДНК фага X в качестве вектора.

Фаг М13 — это одноцепочечная циклическая ДНК длиной около 6500 нуклеотидов. После инфицирования бактериальной клетки одноцепочечная ДНК фага превращается в двуцепочечную реп- ликативную форму (RF), которая подобна плазмиде. Фаговая ДНК содержит, кроме того, короткий участок из 500 нуклеотидов, на­званный как МП (межгенная последовательность), не существен­ный для ее жизнедеятельности. Именно в этот участок МП репли- кативной формы ДНК после расщепления ее с помощью лигазы вставляют чужеродную ДНК. Введение рекомбинантной двуцепо- чечной молекулы в клетку Е. coli приводит к ее репликации, син­тезу (+) цепи, упаковке последней в белковый чехол и выделе­нию фага в среду. Инфицированная нитевидным фагом клетка про­должает делиться, выделяя в окружающую среду большое коли­чество фага. Этот фаг содержит в вирионе одноцепочечную цик­лическую ДНК, в которую встроена одна из цепей чужеродной ДНК.

Векторные плазмиды и векторные вирусы со встроенными чу-⁴ жеродными генами часто называют гибридными (или химернымиi); плазмидами (или фагами). После конструирования рекомбинант-f ных ДНК их с помощью трансформации вводят в реципиентный организм: бактериальную, грибную, растительную или животнук? клетку. Трансформация предусматривает предварительную o6paf ботку клеток соединениями, обусловливающими проникновени| ДНК внутрь клеток с последующим их помещением в среду, I которой способны существовать только клетки, получившие вещ торную молекулу, например в среду с определенным антибий тиком. 1

120

Процесс инфицирования клеток с помощью чужеродных ДНК, приводящий к образованию зрелого фагового потомства, назван трансфекцией.

Практически общий способ трансформации и трансфекции основан на том, что при обработке клеток бактерий СаС1₂ их мем­брана становится проницаемой для ДНК. Однако эффективность проникновения экзогенной ДНК в клетку довольно низка. Поэто­му среди бактерий, подвергшихся трансформации, только неболь­шая часть оказывается трансформированной. Отделение ее от об­щей массы осуществляется в процессе клонирования. Для клони­рования бактериальную суспензию определенной концентрации выливают на твердую питательную среду, например на агар с питательными добавками в чашке Петри из расчета 5—10 бакте­рий на 1 см² поверхности. Бактериальная клетка на поверхности агара начинает делиться с образованием в итоге маленькой коло­нии, похожей на шляпку гриба. Эта колония называется клоном, причем из каждой клетки образуется свой клон, все клетки кото­рого имеют свойства бактерии-родоначальника.

Отбор бактерий-трансформантов можно продемонстрировать, используя плазмиду pBR322 (см. рис. 5.10), содержащую два гена устойчивости к тетрациклину и ампициллину. Для отбора этих бак­терий в агар добавляют антибиотик — или ампициллин, или тет­рациклин в зависимости от того, какой из генов (Ыа или tet) ос­тался интактным после введения чужеродной ДНК. На такой сре­де клоны образуют клетки только с плазмидами. Для отделения рекомбинантных бактерий часть материала каждого клона пере­носят на другую чашку Петри, содержащую антибиотик, ген ус­тойчивости к которому был разрушен при создании рекомбинан- тов. На этих чашках Петри дают клоны только те бактерии, кото­рые содержат исходную плазмиду, а рекомбинантные бактерии их не образуют. Такая тщательная селекция клонов по устойчиво­сти к антибиотику позволяет идентифицировать рекомбинантные клоны. При поиске рекомбинантных клонов успешно применяют метод авторадиографии.