Методы микробиологической диагностики бактериальных инфекций
Вбактериологии для обнаружения возбудителя в исследуемом материале используют бактериоскопический, бактериологический, биологический методы.
Достоинствами бактериоскопического метода являются его простота, быстрота, экономичность. Однако он находит ограниченное применение, так как может быть использован лишь при наличии каких-либо морфологи-
ческих или тинкториальных особенностей возбудителя и при достаточном его содержании в исследуемом материале. Как правило, этот метод является ориентировочным.
Основной, самый точный метод диагностики бактериальных инфекций — бактериологический, который используют почти при всех заболеваниях, несмотря на такие его недостатки, как длительность исследования (от 4—5 дней до 2 месяцев), опасность (так как накапливается чистая культура возбудителя), сравнительная дороговизна. В том случае, если в исследуемом материале предполагается содержание возбудителя в достаточном количестве, посев материала производят на плотные питательные среды для получения изолированных колоний. При незначительном содержании микробов исследуемый материал прежде засевают на жидкие питательные среды — среды обогащения. Идентификацию выделенной чистой культуры производят по морфологическим, тинкто-риальным, культуральным, биохимическим, антигенным и токсигенным свойствам (в зависимости от вида возбудителя). Определение перечисленных свойств позволяет установить вид возбудителя. С целью эпидемиологического маркирования производят внутривидовую идентификацию выделенной культуры: определяют ее фаговар, биовар и др. Кроме того, для назначения рационального лечения, как правило, определяют чувствительность выделенной культуры к антибиотикам.
При микробиологической диагностике заболеваний, вызванных условно-патогенными микробами, представителями нормальной микрофлоры, обязательным является определение количества возбудителей в исследуемом материале.
Биологический метод не экономичен, не гуманен и поэтому находит ограниченное применение. В качестве экспериментальных животных используют белых мышей, морских свинок, кроликов, обезьян и других животных.
Постановка диагноза инфекционного заболевания возможна также с помощью серологического метода, направленного на обнаружение либо специфических антител в сыворотке больного, либо специфических антигенов непосредственно в исследуемом материале.
Антитела к возбудителю заболевания появляются, как правило, к концу первой недели болезни. Невозможность обнаружить их в первые дни заболевания является самым большим недостатком метода, особенно в тех случаях, когда заболевание протекает остро. Кроме того, при многих болезнях требуется изучение антителообразования в динамике и выявление увеличения количества антител, что также не разрешает быстро поставить диагноз. Недостатком метода является и то, что он не позволяет точно идентифицировать возбудителя и определить его антибиотикограмму. Но в то же время это совершенно безопасный, относительно недорогой метод, позволяющий за несколько часов поставить диагноз. В настоящее время при ряде болезней определяют не только количество иммуноглобулинов, но и их принадлежность к различным классам.
При некоторых заболеваниях серологический метод применяют для выявления специфических антигенов в исследуемом материале. Поскольку специфические антигены, входящие в состав возбудителя, находятся в патологическом материале с первых минут болезни, этот вариант серологического метода применяют для ускоренной (в течение первого дня болезни) или даже экспресс-диагностики (в течение нескольких часов) инфекционных заболеваний.
В качестве вспомогательного при небольшой группе инфекционных заболеваний используют аллергологический метод, позволяющий выявить повышенную чувствительность к специфическому антигену (аллергену), которым является возбудитель заболевания.
Особенности диагностики анаэробных инфекций.Для микробиологической диагностики анаэробной инфекции используют бакте-риоскопический и бактериологический методы. Серологический метод имеет ограниченное практическое применение из-за отсутствия коммерческих наборов диагностикумов. Для экспресс-диагностики применяется ГЖХ.
Бактериоскопический метод при диагностике анаэробной инфекции имеет незначительную информативность, поскольку анаэробы морфологически не отличаются от аэробных микроорганизмов, кроме тех редких случаев, когда анаэробы имеют характерную морфологию.
Бактериологическое исследование на анаэробы длительно, дорого и трудоемко. Окончательный ответ получают через 7—10 дней с момента забора исследуемого материала. Посев производят на кровяные среды, обогащенные факторами роста (гемин, менадион, редуцирующие добавки). Посевы инкубируют в анаэробных условиях в анаэростатах или перчаточных боксах. Идентификацию выделенных чистых культур проводят на основании изучения культуральных, морфологических и тинкториальных свойств и ферментативной активности. Антигенные свойства анаэробов изучают редко из-за отсутствия коммерческих наборов диагностических сывороток.
Поскольку анаэробы высокочувствительны к токсическому действию кислорода воздуха, для работы с ними необходимо использовать анаэробную микробиологическую технику исследования. Под анаэробной микробиологической техникой понимают комплекс приемов и методов, позволяющих в бескислородных условиях обеспечить доставку материала в микробиологическую лабораторию, выделение и идентификацию анаэробов. С этой целью используют специальное лабораторное оборудование: анаэробные рабочие станции (перчаточные боксы), анаэростаты, инертный газ или газогенераторные системы, вакуумный насос, индикаторы анаэробиоза, транспортные среды, элективные питательные среды для анаэробов и тест-системы для их идентификации.
Для транспортировки образцов, предназначенных для исследования на анаэробы, используют флаконы с транспортными средами, создающие анаэробные условия при транспортировке.
Для создания анаэробиоза в анаэростате откачивают воздух и после трехкратной вакуум-заместительной промывки анаэростаты заполняют бескислородной трехкомпонентной газовой смесью газом из баллона. Можно использовать и химическое связывание свободного кислорода. Для этого используют газогенераторную систему, содержащую борогидрит и бикарбонат натрия, в которой при добавлении воды происходит химическая реакция, протекающая со связыванием свободного кислорода и выделением углекислого газа и водорода.
Для контроля анаэробиоза в процессе инкубации посевов используют индикаторы анаэробиоза — резазурин или метиленовую синь. В анаэробных бескислородных
условиях индикатор анаэробиоза находится в восстановленной бесцветной форме, а при наличии кислорода — в окисленной окрашенной. Резазурин окрашивается в розовый цвет, а метиленовая синь — в голубой.
При наличии в лаборатории большого объема анализов целесообразно применение анаэробных рабочих станций, которые представляют собой защитный бокс 3-го класса (изолирующий) и являются газонепроницаемыми конструкциями, заполненными бескислородной газовой смесью.
Через 24—48 ч инкубирования посевов в аэробных и анаэробных условиях проводят дифференциацию выросших чистых культур на аэробы и анаэробы. Культуры, выросшие только в аэробных условиях, но не давшие роста в анаэробных условиях, рассматривают как аэробы; культуры, выросшие одновременно в аэробных и анаэробных условиях, рассматривают как факультативные анаэробы и в дальнейшем их идентифицируют по общепринятым схемам. Культуры, не выросшие в аэробных условиях, но давшие рост в анаэробных условиях, рассматривают как облигатные анаэробы и приступают к их идентификации.
Идентификацию анаэробов проводят в два этапа. На первом этапе идентификации ориентировочно определяют родовую принадлежность изолированных анаэробных культур. На втором этапе проводят окончательную идентификацию до вида по биохимическим тестам, антигенным свойствам и по изучению конечных продуктов бактериального метаболизма в среде культивирования с помощью метода ГЖХ.
При идентификации анаэробов до рода учитываются культуральные, морфологические и тинкториаль-ные свойства, а также фенотипы исследуемых культур по отношению к анаэродискам. Анаэродиски — это диски, пропитанные антибиотиками, желчью и бриллиантовым зеленым. Обычно используют следующие анаэродиски: канамицин — 1000 мкг/мл, пенициллин — 2 ЕД, полимиксин В — 100 ЕД, эритромицин — 60 мкг/мл, рифампицин — 15 мкг/мл, ристо-мицин — 5 мкг/мл, желчь — 5 мг/мл и диск с бриллиантовым зеленым — 100 мкг. Ориентировочную родовую идентификацию проводят, сравнивая полученный фенотипический профиль с таблицей фено-типических профилей анаэробных микробов.
Зная ориентировочную родовую принадлежность анаэробного микроба, его вид определяют с помощью биохимических тестов, а в случае необходимости — и по конечным продуктам бактериального
метаболизма, выделяемым в среду культивирования с помощью ГЖК-метода.
Газовая хроматография. Бактериологическое исследование на анаэробы длительно, трудоемко и дорого. Время, затрачиваемое с момента доставки материала в микробиологическую лабораторию до получения полного развернутого ответа, составляет от 7 до 10 суток, что абсолютно не удовлетворяет требованиям клиницистов. Это обусловлено медленным ростом, а также необходимостью изучения многочисленных таксономических признаков при идентификации выделенных чистых культур.
Использование метода ГЖХ для экспресс-диагностики анаэробной инфекции основано на хроматографическом определении в исследуемом материале специфических продуктов метаболизма анаэробов — летучих жирных кислот, которые служат метаболическими маркерами наличия анаэробов. Конечными высокоспецифичными продуктами метаболизма углеводов у анаэробов являются жирные кислоты. Различают корот-коцепочечные или летучие жирные кислоты С2-С7 и длинноцепочечные нелетучие кислоты. Определение в исследуемом материале наличия жирных кислот с помощью ГЖХ является убедительным доказательством анаэробной этиологии воспалительного процесса. Методом ГЖХ технически более просто определять летучие жирные кислоты. При этом метаболическими маркерами анаэробов являются изомасляная и масляная, изовале-риановая и валериановая, изокапроновая и капроновая, гексановая и каприловая кислоты. Аэробные бактерии летучие жирные кислоты не продуцируют.
Для хроматографического анализа проводят экстракцию летучих жирных кислот эфиром или другими летучими органическими растворителями. Экстракт вводят в хроматограф. Чувствительность метода — Ю-6 г/л; время анализа — 30-50 мин. Идентификацию летучих жирных кислот осуществляют по относительному времени удерживания, для сравнения используют аналитические стандарты жирных кислот. Обнаружение в исследуемом материале одной или нескольких летучих жирных кислот, особенно изокис-лот с разветвленной углеродной цепочкой, является убедительным доказательством наличия анаэробов.
Для получения более подробной информации о метаболической активности анаэробов определяют длинноцепочечные жирные кислоты, которые переводят в летучие производные, например метиловые эфиры, многоатомные спирты, ароматические соединения, углеводные соединения, аминосахара, аминокислоты, пурины и т. п. Наличие в исследуемом материале длинноцепочечных жирных кислот также является убедительным доказательством анаэробной природы воспалительного процесса. Анализ метиловых эфиров жирных кислот необходим, если в пробе отсутствуют летучие жирные кислоты или определяется только одна уксусная кислота.
Наличие в исследуемом материале только уксусной или пропионовой кислоты не может служить достоверным доказательством наличия анаэробов, так как эти кислоты могут продуцироваться некоторыми факультативными анаэробами, такими как Staphylococcus aureus, Esherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella spp. Обнаружение в патологическом материале только молочной или яблочной жирных кислот также не может быть веским доказательством наличия анаэробов, так как эти кислоты являются нормальными метаболитами тканей человека.
Очень важное значение при индикации анаэробов в патологическом материале приобретают ложноположительные и ложноотрица-тельные результаты ГЖХ-анализа. Под ложно-положительными результатами ГЖХ-анализа понимают такие результаты, когда на хрома-тограмме присутствуют пики жирных кислот, а бактериологически облигатные анаэробные бактерии не выделяются. Под ложноотрица-тельными результатами ГЖХ-анализа понимают такие результаты, когда на хроматограмме отсутствуют пики жирных кислот, хотя анаэробы присутствуют в изучаемой пробе и могут быть выделены бактериологически.
Причины ложных результатов ГЖХ-анализа при исследовании на анаэробы приведены в табл. 15.2.
Дата добавления: 2016-02-04; просмотров: 2392;