Иммуноферментный метод, или анализ (ИФА)
ИФА — выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгирован-ных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бета-галактозидазой или щелочной фос-фатазой). После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в
смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом, и изменяется цвет продукта реакции — интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.
Твердофазный ИФА — наиболее распространенный вариант иммунологического теста, когда один из компонентов иммунной реакции (антиген или антитела) сорбирован на твердом носителе, например в лунках планшеток из полистирола (рис. 13.11).
При определении антител в лунки планшеток с сорбированным антигеном последовательно добавляют сыворотку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом, и субстрат (хромоген) для фермента.
Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшие-ся реагенты путем тщательного промывания. При положительном результате изменяется цвет раствора хромогена. Твердофазный носитель можно сенсибилизировать не только антигеном, но и антителами. Тогда в лунки с сорбированными антителами вносят искомый антиген, добавляют иммунную сыворотку против антигена, меченную ферментом, а затем субстрата для фермента.
Конкурентный вариант ИФА: искомый антиген и меченный ферментом антиген конкурируют друг с другом за связывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки. Другой тест — искомые антитела
и меченые антитела конкурируют друг с другом за антигены.
ИФАприменяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней в частности для диагностики ВИЧ-инфекций, гепатита В и др., а также определения гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях — 10'°—1012 г/л.
13.6.3. Радиоиммунологический метод, или анализ (РИА)
Высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген—антитело с применением антигенов или антител, меченных радионуклидом (l25J, 14С, 3Н, 51Сr и др.). После их взаимодействия отделяют образовавшийся радиоактивный иммунный комплекс и определяют его радиоактивность в соответствующем счетчике (бета- или гамма-излучение):
интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.
При твердофазном варианте РИАодин из компонентов реакции (антиген или антитела) сорбирован на твердом носителе, например в лунках микропанелей из полистирола. Другой вариант метода — конкурентный РИА:искомый антиген и меченный радионуклидом антиген конкурируют друг с другом за связывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки. Этот вариант используют для определения количества антигена в исследуемом материале.
РИАприменяют для выявления антигенов микробов, определения гормонов, ферментов, лекарственных веществ и иммуноглобулинов, а также иных веществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях — 10~12— 10~15 г/л. Метод представляет определенную экологическую опасность.
13.6.4. Иммуноблоттинг
Иммуноблоттинг (ИБ) — высокочувствительный метод, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА.
Антиген выделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят его (блоттинг — от англ. blot, пятно) из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлоз-ную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с «блотами»
антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем после инкубации отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс антиген + антитело больного + антитело против Ig человека выявляют добавлением субстрата/хромогена, изменяющего окраску под действием фермента (рис. 13.12).
ИБ используют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др.
Дата добавления: 2016-02-04; просмотров: 1112;