Генетическая инженерия и область ее применения в биотехнологии

Генетическая инженерия является серд­цевиной биотехнологии. Она, по сущест­ву, сводится к генетической рекомбинации, т. е. к обмену генами между двумя хромо-сами, которая приводит к возникновению клеток или организмов с двумя и более на­следственными детерминантами (генами), по которым родители различались между собой. Метод рекомбинации in vitro или генетической инженерии заключаются: а) в выделении или синтезе ДНК из отличаю­щихся друг от друга организмов или клеток: б) получении гибридных молекул ДНК; в) введении рекомбинатных (гибридных) мо­лекул в живые клетки; г) создании условий

для экспрессии и секреции продуктов, ко­дируемых генами.

Гены, кодирующие те или иные структу­ры, или выделяют (клонируют) как таковые (хромосомы, плазмиды), или прицельно вы-щепляют из этих генетических образований с помощью ферментов рестрикции. Набор этих ферментов, а их уже известно более тысячи, способны резать ДНК по многим определен­ным связям, что является важным инструмен­том генной инженерии.

В последнее время обнаружены фермен­ты, расщепляющие по определенным связям РНК, наподобие рестриктаз ДНК. Эти фер­менты названы рибозимами.

Чтобы представить генетические структуры клеток человека, бактерий, а также вирусов, приведем такие данные. Бактериальная хро­мосома представляет собой молекулу ДНК длиной 1 мм, состоящую приблизительно из 3 млн пар нуклеотидов. В клетке она компак­тно уложена несколько тысяч раз и занимает пространство менее 1 мкм в поперечнике. В клетках человека ДНК организована в 46 хро­мосом, каждая из которых содержит молекулу ДНК длиной 4 см, а полное число нуклеоти­дов в ней приближается к 3 млрд пар.

Сравнительно небольшие гены могут быть получены с помощью химического синтеза. Для этого вначале расшифровывают число и последовательность аминокислот в белковой молекуле вещества, а затем по этим данным узнают очередность нуклеотидов в гене, пос­кольку каждой аминокислоте соответствуют три нуклеотида (кодон). С помощью синте­затора создают химическим путем ген, анало­гичный природному гену.

Полученный одним из способов целевой ген с помощью ферментов лигаз сшивают с другим геном, который используется в качес­тве вектора, для встраивания гибридного гена в клетку. Вектором могут служить плазмиды, бактериофаги, вирусы человека, животных и растений.

Для РНК-вирусов передача генетической информации возможна с помощью ревертазы (обратной транскриптазы), которая переда­ет информацию о структуре белка от РНК к ДНК, которая является комплементарной информационной РНК.

Экспрессируемый ген в виде рекомбинатной ДНК (плазмида, фаг, вирусная ДНК) встраи­вается в бактериальную или животную клетку, которая приобретает новое свойство — проду­цировать несвойственное этой клетке вещест­во, кодируемое экспрессируемым геном.

В качестве реципиентов экспрессируемого гена чаще всего используют Е. coli, В. subtilis, псевдомонады, дрожжи, вирусы. Реципиента подбирают не только с учетом возможности встройки чужеродного гена, но и уровня выра­женности (экспрессии) синтеза вещества, ко­дируемого геном, возможности его секреции в окружающую среду, легкости и доступности массового культивирования, экологической безопасности. Некоторые штаммы рекомби-нантных бактерий способны переключать на синтез чужеродного вещества, экспрессиру­емого геном, до 50 % своей синтетической возможности. Такие штаммы — суперпро­дуценты целевых продуктов уже получены и применяются в биотехнологической про­мышленности. В качестве примера можно привести штаммы — суперпродуценты трип­тофана, интерферона и других веществ.

Некоторые штаммы микроорганизмов хо­рошо экспрессируют чужеродные гены, но плохо секретируют продукт в окружающую среду. В таких случаях приходится прибегать к дезинтеграции (разрушению) клетки с це­лью высвобождения из нее синтезированного продукта. Иногда, несмотря на наличие экс­прессии и секреции продукта клеткой, его не удается получить, вернее — собрать, из-за разрушения в процессе синтеза или после него протеазами и другими ингибиторами. В некоторых случаях с целью повышения уровня секреции целевого белка к гену целе­вого белка присоединиют ген-индикатор, т. е. ген, кодирующий легко узнаваемый белок, в результате этой манипуляции получают хи­мерный белок, а из него — целевой белок. В качестве индикатора может быть, например, (beta-галактозидаза, можно использовать ген ин­терферона и т. д.

Методом генетической инженерии созданы сотни препаратов медицинского и ветеринар­ного назначения, получены рекомбинантные штаммы-суперпродуценты, многие из кото­рых нашли практическое применение. Уже

применяются в медицине полученные мето­дом генетической инженерии вакцины про­тив гепатита В, интерлейкины-1, -2, -3, -6 и другие, инсулин, гормоны роста, интерферо-ны а, В, у, фактор некроза опухолей, пептиды тимуса, миелопептиды, тканевой активатор плазминогена, эритропоэтин, антигены ВИЧ, фактор свертываемости крови, моноклональ-ные антитела и многие антигены для диагнос­тических целей.

Разработаны и в ближайшие годы будут использованы в практике генно-инженерные вакцины против малярии, ВИЧ-инфекции, сифилиса, клещевого энцефалита, холеры, бруцеллеза, гриппа, бешенства и других ин­фекций; интерлейкины-6—18, пептиды ти­муса, колониестимулирующие факторы, эпи-дермальный фактор роста, атриальный пеп­тид, фактор тромбоцитов, рекомбинантные антигены многих бактерий и вирусов, ней-ропептиды и другие поведенческие пептиды, рецепторы клеток, ферменты, метаболиты, тканевые антигены, антигены опухолей и др.

Работы по созданию рекомбинантных пре­паратов ведутся широким фронтом. Быстрому внедрению их в практику препятствуют сле­дующие преодолимые обстоятельства.

Во-первых, длительное время к генно-ин­женерным препаратам и рекомбинантным штаммам микроорганизмов относились на­стороженно и даже с опаской, боясь, что мо­жет произойти неуправляемое распростране­ние экологически опасных рекомбинантных микробов, а в препаратах может содержаться нежелательная для организма генетическая информация. Однако в настоящее время эти опасения практически сняты, так как доказа­на безопасность при соблюдении определен­ных правил и самих рекомбинантных штам­мов, и препаратов, полученных на их основе.

Во-вторых, использование рекомбинант­ных штаммов-продуцентов предусматривает разработку сложных технологических про­цессов по получению и выделению целевых продуктов. На разработку технологии обычно затрачивается значительно больше средств, чем на получение штамма.

В-третьих, при получении препаратов ген­но-инженерным способом всегда возникает вопрос об идентичности активного начала, вырабатываемого рекомбинантным штам­мом-продуцентом, природному веществу, т. е. требуется проведение исследовательских работ, направленных на доказательство их идентичности, а также иногда для решения дополнительных задач по приданию продукту природного характера.

Тем не менее генно-инженерный способ относится к числу перспективнейших при получении многих белковых биологических веществ, ценных для медицины.

Таким образом, биотехнология проникла во все сферы науки и производства, стала не­заменимой в жизни людей. Мы переживаем ее бурный расцвет, каждый день приносит новые результаты. Развитие биотехнологии во всех странах порождает конкуренцию на рынках сбыта. Так, сейчас за рынки сбыта генно-инженерных продуктов (вакцина про­тив гепатита В, интерферон, интерлейкин и др.) за рубежом конкурируют десятки и сотни фирм. Это определяет темпы развития, с од­ной стороны, а также служит движущей силой поиска и разработки новых продуктов для ме­дицины, ветеринарии, промышленности — с другой. Будущее за биотехнологией, как на­иболее природной и рациональной сферой в области производства многих жизненно цен­ных продуктов, в том числе медицинского назначения.