СИНТЕЗ СОМАТОТРОПИНА

В ряду гормональных препаратов, получаемых биотехнологическими методами, особое место занимает соматропин – гормон роста человека (ГРЧ, рГРЧ). Нарушения роста у детей занимают третье место в структуре детской эндокринной патологии. Наиболее выраженные клинические проявления и тяжелый прогноз заболевания имеют дети, страдающие соматотропной недостаточностью.

Соматотропин (или гормон роста человека ГРЧ) секретируется передней долей гипофиза. Впервые он был выделен и очищен в 1963 г. из гипофиза. Его недостаток приводит к заболеванию - гипофизарной карликовости (1 случай на 5000 человек). Гормон обладает видовой специфичностью. Обычно его получают из гипофи­за трупов, но в недостаточном количестве. Гормона хватает лишь для лечения 1/3 случаев гипофизарной карликовости в развитых стра­нах. Основные производители - Швеция, Италия, Швейцария и США. Молекула ГРЧ состоит из 191 аминокислотного остатка.

Препарат из трупного материала представляет собой смесь из нескольких форм, из которых пять имеют молекулярную массу 22 кДа, другие являют­ся димерами, а остальные - фрагментами, образующимися при протеолизе. Это приводило к тому, что у 30 % больных, получав­ших препарат, против гормона вырабатывались антитела, сводив­шие на нет его биологическую активность.

Определение аминокислотной последовательности ГРЧ и клонирование его гена позволило уже в начале 80-х годов ХХ века получить первые препараты рекомбинантного ГРЧ (рГРЧ) для применения в медицинской практике.

Будучи синтезированным в клетках Е. coli, ГРЧ содержит дополнительный остаток метионина на H₂N-концe молекулы. Биосинтез ГРЧ из 191 аминокислот­ного остатка был осуществлен в 1979 г. Д.Гедделем с сотрудника­ми. Сначала клонировали двунитевую кДНК; далее путем расщеп­ления получали последовательность, кодирующую аминокислот­ный порядок гормона, за исключением первых 23 аминокислот, - с фен (—NH₂) до лей (23), и синтетический полинуклеотид, со­ответствующий аминокислотам от первой до двадцать третьей со стартовым ATG-кодоном в начале. Затем два фрагмента объеди­няли и подстраивали к паре lac-промоторов и участку связыва­ния рибосом. Конечный выход гормона составил 2,4 мкг на 1 мл культуры, что составляет 100 000 молекул гормона на клетку. Полученный гормон на конце полипептидной цепи содержал дополнительный остаток метионина и обладал значительной био-

логической активностью. С 1984 г. после серьезных клинических ис­пытаний на токсичность компанией «Генетех» (Сан-Франциско, США) было начато широкомасштабное производство бактериального соматотропина.

ГРЧ в клетках Е. coliи в культуре клеток животных был получен в 1982 г. одновременно в Институте Пастера (Париж) и в Институ­те молекулярной биологии (Москва). Оказалось, что в бактериаль­ных клетках возможен синтез аналогов ГРЧ, с помощью которых изучались участки молекулы, важные для стимулирования роста и процесса неоглюкогенеза на молекулярном уровне.

Огромный интерес представляют выделение и синтез поли­пептида, обладающего полной биологической активностью гипоталамического рилизинг-фактора соматотропина(СТГ-РФ). Вве­дение этого фактора способно компенсировать недостаток сома­тотропина. Таким образом, наличие СТГ-РФ и самого гормона, полученных в генетически сконструированных бактериальных клет­ках, очень важно для успешного лечения заболеваний, обуслов­ленных недостатком этого гормона, и ряда патологических забо­леваний, таких, как некоторые формы диабета, регенерация тка­ней после ожогов и др. Предполагается, что СТГ-РФ можно ис­пользовать и для увеличения массы и роста домашних животных, так как он, не обладая видовой специфичностью, способен сти­мулировать освобождение гормона роста у ряда животных.

Эндорфин

β-Эндорфин - опиат мозга, состоящий из 31 аминокислотного остатка, был синтезирован в генетически сконструированных клет­ках в 1980 г. группой ученых из Австралии и США. β-Эндорфин получен в клетках Е. coliв виде гибридного белка с β-галактозидазой. Процедура синтеза β-эндорфина включала: получение пу­тем обратной транскрипции мРНК - кДНК, кодирующей белок-предшест-венник, содержащий помимо последовательности β-эндорфина последователь-ность АКТГ и (β-липотропина (β-ЛТТ), в дальнейшем удаляемые. (β-Эндорфин, полученный из гибридного белка и тщательно очищенный, обладал значительной биологи­ческой активностью. Он специфически взаимодействовал с анти­сывороткой против β-эндорфина. От β-эндорфина человека ген­но-инженерный β-эндорфин отличался по двум аминокислотам, и эти отличия можно было легко устранить на нуклеотидном уровне путем замены двух кодонов в ДНК бактериальной плазмиды.

В 1978 г. сотрудниками Института биоорганической химии под руководством акад. Ю. А. Овчинникова был осуществлен синтез двух структур-ных генов, кодирующих синтез нейропептидов: лейцин-энкефалина и брадикинина.

Иммуномодуляторы

Иммуномодуляторы - это природные или синтетические препараты, способные оказывать регулирующее действие на функции иммунной систе­мы; кроме того, их влияние распространяется на другие системы организма: сосудистую, нервную, эндокринную, кроветворную.

Иммуномодуляторы синтезируются клетками организма (цитокины, гормоны, биологически активные пептиды), их также получают путем био­синтеза или химического синтеза и применяют в качестве лечебных и про­филактических средств при различных заболеваниях и трансплантации.

Интерлейкины получают, используя в качестве продуцентов культуры нормальных лимфоцитов или макрофагов, культуры Т-клеточных гибри­дов и рекомбинантные клетки микроорганизмов. Т-клеточные гибридомы -это продукты слияния Т-лимфоцитов, продуцирующих определенный интерлейкин, и опухолевых клеток, способных к неограниченному росту. В ка­честве рекомбинантных продуцентов используют Е. coli, Saccharomyces cerevisiae и другие микроорганизмы, в геном которых методами генетической инженерии введены гены, контролирующие синтез интерлейкина (ИЛ-1, ИЛ-2).

Колониеспшмулирующие факторы (КСФ) - это разновидность цитокинов с преимущественным действием на гемпоэз, служат факторами выжи­ваемости и роста кроветворных предшественников. Рекомбинантные препа­раты КСФ (лейкомакс, молграстим, лейкоген, ленограстим) используют для нормализации подавленного гемопоэза и активации иммунной системы, в частности, на фоне цитотоксической терапии опухолей и индуцированной иммунодепрессии при трансплантации.

Среди цитокинов ранее всего в медицинскую практику вошли препара­ты интерферона, которые используют при вирусных и некоторых злокачественных заболеваниях.

Интерфероны (ИФН) - это группа белков и гликопротеинов, каждый из которых синтезируется определенными клетками организма и выполня­ет специфические функции. Известно около 20 природных ИФН, различаю­щихся по структуре и биологическим свойствам: α-ИФН состоит из 12 под­видов, β-ИФН - из 3-4 подвидов, γ-ИФН - из 2-3 подвидов. Рекомбинантные ИФН также имеют разновидности.

Продуцентом α-ИФНявляются лейкоциты периферической крови че­ловека, которые культивируют на специальной среде в присутствии вируса -интерфероногена. Нативный ИФН выделяют из культуральной жидкости осаждением и хроматографией. Метод имеет ограниченное применение из-за необходимости использования большего количества донорской крови.

β-ИФНсинтезируется в культуре фибробластов (клеток соединитель­ной ткани человека) в присутствии в качестве интерфероногена двухцепочечной РНК.

γ-ИФИ- в культуре иммунных Т- или В-лимфоцитов, в том и другом случае с низким выходом, поэтому производство с использованием культур клеток человека - процесс дорогостоящий. Экономически оправда­но получение ИФН с использованием рекомбинантных культур микроорга­низмов: Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Saccharomyces cerevisiae. Очистку ИФН проводят методом аффинной хроматографии с использова­нием моноклональных антител.

Технологическая схема получения генно-инженерных интерферонов (как одна из возмож­ных) принципиально сводится к следующему:

1. индукция синтеза и выделение интерфероновой мРНК из клеток,

2. получение кДНК, комплементарной интерфероновой мРНК из

лейкоцитов,

3. встраивание кДНК в плазмиду,

4. введение реконструированной плазмиды в клетки Е. coli,

5. размножение бактерий, содержащих реконструированную плазмиду, в

культуральной среде,

6. сепарирование клеток Е. coli,

7. дезинтеграция и экстракция клеток Е. coli,

8. осаждение (например, полиэтиленамином) с последующим центрифуги-

ованием,

9. высаливание интерферона из супернатанта сульфа­том аммония

10. диализ осадка интерферона,

11. растворение интерферона, пропускание раствора через колонку с имму-

носорбентом (пришитыми моноклональными антителами),

12. элюция интерферона с последующей хроматографией на целлюлозном

катионообменнике.