Направленный мутагенез

Технология рекомбинантных ДНК позволяет выделять гены любых белков, существующих в природе, экспрессировать их в специфическом хозяйском организме и получать чистые белко­вые продукты. Однако физические и химиче­ские свойства таких «природных» белков часто не удовлетворяют условиям, обеспечивающим возможность их промышленного применения. Иногда для получения белков, обладающих нужными свойствами, в качестве источника со­ответствующих генов используют организмы, растущие в необычных, зачастую экстремаль­ных условиях. Например, для синтеза ά-амилазы, не утрачивающей своей активности при вы­сокой температуре, выделили ее ген из Bacillus stearothermophilus-бактерии, естественной сре­дой обитания которой являются горячие источ­ники с температурой воды 90 °С. Полученная та­ким образом α-амилаза оставалась активной при более высоких температурах, чем те при которых обычно осуществляют промышленное производство этилового спирта из крахмала. Это значительно облегчает поддержание асептических условий и ускоряет процесс.

Для получения белков с заранее за­данными свойствами можно использовать также мутантные формы генов. Однако число мутантных белков, образующихся в результате замены отдельных нуклеотидов в структурном гене с по­мощью обычного, классического мутагенеза, чрезвычайно ве­лико. Однако даже мутагенез с последующим отбором редко приводит к существенному улучшению свойств исходного белка, поскольку большинство ами­нокислотных замен (мутаций) сопровождается снижением активности фермента.

Для создания белков со специфическими свой­ствами можно использовать другой подход, осно­ванный на целенаправленном внесении изменений в кодирующие их клонированные гены (направленный мутагенез). Это позволяет получать белки с другими, чем у их аналогов, свойствами.

1. С более высокой каталитической активностью

2. Более высокой специфичностью

3. С более высокой стабильностью (температура, диапазон рН)

4. Способные функционировать в безводных растворителях

5. Обладающие и сохраняющие каталитическую активность без участия кофакторов

6. Обладающие повышенной устойчивостью к клеточным протеазам

Направленный мутагенез: методика

Получить принципиально новый белок с заранее заданными необычными свойствами - задача, в настоящее время еще не разрешимая. Однако сейчас вполне реаль­но целенаправленно и существенно изменить свойства уже существующих белков. Изменения можно вносить в сам белок, однако химическая модификация белков редко бывает специфичной и ее необходимо осуществлять заново для каждой белковой молекулы. Поэтому лучше вносить изменения в ген, кодирующий синтез этого белка.

Введение специфических изменений в кодирующие последовательности ДНК, приводящих к определенным изменениям в аминокислотных последовательностях, называется направленным мутагенезом. Процедура осуществляется с использованием стандартных методов генной инженерии и не составляет особого труда. Основная сложность заключается в том, что не всегда известно, какую аминокислоту или последовательность аминокислот нужно изменить, чтобы получить белок с нужными свойствами. Изменения могут затрагивать аминокислотные остатки, расположенные в разных участках полипептидной цепи, которые потом сближаются при укладке белковой молекулы. Выбор аминокислоты, подлежащей замене, как правило, производится эмпирически, с учетом ее роли в функционировании белка. Данные об этом получают в ходе биохимических исследований или в методом рентгеноструктурного анализа трехмерной структуры белка или лучше комплекса белок - лиганд(субстрат). Поэтому положительный результат пока достигается достаточно редко.

В последнее время значительное развитие получил перспективный подход к получению высокоактивных белков, основанный на использовании методов компьютерного молекулярного дизайна. В качестве примера можно привести работу сотрудников МГУ по созданию эффективных биокатализаторов-ферментов, значительно превосходящих природные аналоги.

В качестве модели был взят фермент пенициллинацилаза из Е. Coli, который широко применяется в фармацевтических производствах для получения полусинтетических пенициллинов. Его химическая и пространственная трехмерная структура установлена уже довольно давно. С помощью специально разработанной компьютерной программы было смоделировано улучшение свойств этого фермента. Для повышения активности и специфичности фермента виртуально варьировались (заменялись) аминокислотные остатки его активного центра, которые участвуют в связывании субстрата. Для каждой мутации проверялось (виртуально, методом молекулярного докинга) сродство новой формы фермента к субстрату. Мерой сродства служила величина энергии связывания субстрата с виртуальной молекулой фермента Всего было проскринировано более 3000 мутантных форм фермента, несущих произвольные одиночные и двойные мутации, среди которых были обнаружены мутантные формы, связывающие субстрат почти в 100 раз лучше природного фермента. Далее зная структуру такого высокоэффективного мутанта можно искусственно сконструировать фрагмент ДНК, кодирующий его аминокислотную последовательность и в дальнейшем клонировать его в подходящем организме – хозяине.

В настоящее время подобные исследования являются достаточно дорогими и трудоемкими и в основном еще не вышли за рамки научных лабораторий. Есть надежда, что уже в ближайшем будущем развитие протеомики, аналитической и компьютерной техники позволит точно и быстро предсказывать свойства того или иного белка, исходя из данных о его аминокислотной последовательности. Это значительно упростит процедуру искусственного создания нужных белков с заданными свойствами.