Метаболитическая перегрузка

 

Как мы уже отмечали введение в клетку чужеродной ДНК, и ее экспрессия часто приводят к различным нарушениям клеточного метаболизма. Это явление носит название метаболитическая перегрузка и может возникать по разным причинам:

1.Увеличение затрат энергии (АТФ) и метаболитов на экспрессию, как клонированного гена так и генов самого вектора, и возможность их истощения.

2. Нехватка кислорода и невозможность обеспечения им всех метаболити-ческих реакций, как нужных для клетки, так и для экспрессии клонируемого гена.

3. Нарушение внутриклеточной локализации и экспорта жизненно важных клеточных белков, вследствие перепроизводства чужеродного белка

Это может привести к таким нежелательным явлениям как снижение скорости роста трансформированных клеток, потере ими рекомбинантных плазмид или удалению рекомбинантного гена из плазмиды.

Поскольку клеткам, растущим в условиях мета­болической перегрузки, не хватает энергии для нормального функционирования, нарушения затрагивают прежде всего такие энергоемкие метаболические процессы, как фиксация азота или синтез белков. Могут изменяться также размер и форма клеток, образовываться слишком много внеклеточного полисахарида, склеивающего клетки друг с дру­гом и затрудняющего микрофильтрацию.

Как следствие метаболической перегрузки, обусловленной образованием избыточного ко­личества чужеродного белка и нехваткой пита­тельных веществ или «строительных блоков» - аминокислот, может произойти запуск стрессо­вых механизмов, в частности инициироваться синтез клеточных протеаз, под действием ко­торых произойдет быстрая деградация рекомбинантного белка.

Многократно возрастает вероятность трансляционных ошибок. Так для Е. Coli в нормальных условияхонасоставляет 2•10-4 - 2•10-3 % на 1 клетку за генерацию. Однако в условиях нехватки опреде­ленных аминоацил-тРНК или гуанизинтрифосфата, что часто случается при суперпродукции чужеродных белков, веро­ятность включения в белковую молекулу непра­вильной амино-кислоты, вместо недостающей сильно увеличивается (в десятки и сотни раз).

Это не позволяет использовать синтезируемый белок в качестве лекарствен-ного средства, поскольку:

1) удельная активность и стабильность белка могут быть гораздо ниже ожидаемых;

2) наличие в молекуле «неправиль­ных» аминокислот может вызвать нежелатель­ную иммунологическую реакцию при введении такого белка в организм человека.

Для снижения влияния метаболитической перегрузки используют следующие подходы или их комбинацию:

1.Использование малокопийных плазмидных векторов.

2.Отказ от использования векторов и встраивание клонируемого вектора в хромосомную ДНК организма-хозяина.

3. Использование регулируемых промоторов.

 

4. На практике эффективным спосо­бом увеличения количества чужеродного белка, синтезируемого рекомбинантным микроорганиз­мом, состоит в поддержании уровня экспрессии его гена на среднем уровне (так, чтобы на долю продукта приходилось примерно 5% суммарного клеточного белка), но при максимальной плотности клеточной культуры, что достигается подбором соответствующих условий (аэрирование, перемешивание, термостатирование). Так микробиологиче­ская система с 5%-ным уровнем экспрессии чу­жеродного белка и низкой метаболической нагрузкой, в которой плотность может достигать 40 г/л (масса сухого вещества), оказывается более эффективной, чем система с 15%-ым уровнем экспрессии и плотностью 10 г/л.

 








Дата добавления: 2016-01-30; просмотров: 1379;


Поиск по сайту:

При помощи поиска вы сможете найти нужную вам информацию.

Поделитесь с друзьями:

Если вам перенёс пользу информационный материал, или помог в учебе – поделитесь этим сайтом с друзьями и знакомыми.
helpiks.org - Хелпикс.Орг - 2014-2024 год. Материал сайта представляется для ознакомительного и учебного использования. | Поддержка
Генерация страницы за: 0.004 сек.