Производство аминокислот

Среди соединений, получаемых биотехнологическими метода­ми, аминокислоты занимают первое место по объему производства и второе место по стоимости, уступая по последнему параметру лишь антибиотикам. Объем мирового производства аминокислот со­ставляет более 500 тыс. т в год, из которых 300 тыс. т приходится наглутамат натрия, 100 тыс. т на лизин и 140 тыс. т на метионин. Одна­ко указанный объем — лишь небольшая доля от требуемого коли­чества аминокислот. По данным ВОЗ, потребность человечества всего лишь в четырех незаменимых аминокислотах составляет, млн т: для лизина - 5, метио-нина - 4, треонина - 3,7 и триптофана - 2.

Аминокислоты — структурные единицы белков. Природные ами­нокислоты вовлечены в биосинтез ферментов, ряда гормонов, витаминов, антибиотиков, алкалоидов, токсинов и других азот­содержащих соединений (пурины, пиримидины, гем и пр.). В орга­низме животного практически половина белковых аминокислот не синтезируется. Они называются незаменимыми аминокислота-мии должны поступать в организм с пищей. Недостаток каждой из этих амино-кислот в пищевом или кормовом рационе приводит к нарушению обмена веществ, замедлению роста и развития.

Пищевая ценность белка определяется сравнением доли неза­менимых аминокислот в пище с этим же показателем при адекватном питании. Чем ближе обе величины, тем выше качество белка. Белки яйца и молока обладают высокой пищевой ценностью и используются в качестве эталона при оценке других белков. Мно­гие белки растительного происхождения характеризуются дефи­цитом некоторых незаменимых аминокислот. Так, белки пшени­цы и риса обеднены лизином и треонином, а белки кукурузы - лизином и триптофаном. Введение синтетических незаменимых аминокислот в кормо­вые концентраты позволяет балансировать корма сельскохозяй­ственных животных по уровню белка. При добавлении 2-4 дефи­цитных аминокислот к 1 т комбикорма общий расход кормов уменьшается на 15 - 20 %, выход продукции увеличивается на 20 %. Добавление к кормам аминокислот способствует переводу живот­новодства на промышленную основу.

Помимо применения в качестве пищевых добавок, приправ и усилителей вкуса аминокислоты используют как сырье в хими­ческой, парфюмерной и фармацевтической промышленности и при производстве ряда других веществ:

глицин - подсластитель, антиоксидант, бактериостатик;

1.аспарагиновая кислота - усилитель вкуса, сырье для синтеза аспартама;

2.глутаминовая кислота - усилитель вкуса, препарат для лече­ния психических заболеваний;

3.гистидин - противовоспалительное средство;

4.метионин - пищевая и кормовая добавки;

5.цистеин - фармацевтический препарат;

6.треонин и триптофан - пищевые и кормовые добавки;

7.фенилаланин - сырье для получения аспартама;

8.лизин - пищевая и кормовая добавки, сырье для получения искусственных волокон и пленок.

В промышленных масштабах белковые аминокислоты получают:

1) гидролизом природного белоксодержащего сырья;

2) химическим синтезом;

3) микробиологическим синтезом;

4) биотрансформацией предшественников аминокислот с по­мощью микроорга-низмов или выделенных из них ферментов (хи­мико-микробиологический метод).

При гидролизебелоксодержащее сырье (отходы пищевой и молоч­ной промышленности) нагревают с растворами кислот или щело­чей при температуре 100 — 105 °С в течение 20 — 48 ч. Чаще всего используют 20 %-й раствор соляной кислоты, обеспечивающий глу­бокий гидролиз белка. Кроме того, для ускорения реакции гидро­лиза белков используют иммобилизованные протеолитические фер­менты и ионообменные смолы. В ходе кислотного гидролиза белков происходят рацемизация и разрушение некоторых составляющих их аминокислот. При кислотном гидролизе полностью разрушается триптофан и достаточно значительны потери цистеина, метионина и тирозина (10-30%). Лучшим способом уменьшения потерь аминокислот при гидролизе является проведение его в вакууме или в атмосфере инертного газа, а также соблюдение высокого соотно­шения количества кислоты, взятой для гидролиза, и массы белка (200:1). Рациональное использование сырья при гидролизе, харак­терное для многих других биотехнологических производств, обес­печивает создание безотходных технологий и способствует оздо­ровлению окружающей среды. Ранее методом гидролиза получали аминокислоты исключительно для фармацевтических и научных це­лей. В последнее время сфера использования белковых гидролизатов существенно расширилась. Их применяют в медицине, живот­новодстве, пищевой и микробиологической промышленности.

Существенный недостаток методов химического синтезаами­нокислот состоит в получении целевых препаратов в виде раце­мической смеси D- и L-стереоизомерных форм. Подавляющее боль­шинство природных аминокислот относится к L-ряду. D-aминокислоты обнаружены лишь в составе гликопротеинов клеточ­ных стенок бактерий, антибиотиков и некоторых токсинов. Про­ницаемость L-аминокислот в клетке в 500 раз превышает таковую ее антипода. Стереоспецифичны также транспорт и метаболизм аминокислот. Исключением в этом отношении является лишь метионин, метаболизм которого нестереоизбирателен, благодаря чему данная аминокислота получается преимущественно путем хими­ческого синтеза. Разделение рацематов других аминокислот - до­рогая и чрезвычайно трудоемкая процедура.

Наиболее перспективен и экономически выгоден микробиоло­гическийсинтез аминокислот. Более 60 % всех производимых в на­стоящее время промышленностью высокоочищенных препаратов белковых аминокислот получают именно этим способом, главное преимущество которого в сравнении с методами химического син­теза состоит в возможности получения L-аминокислот на основе возобновляемого сырья.

В последние годы при производстве аминокислот все шире ис­пользуют биотрансформацию предшественников аминокислот, особенно с помощью иммобилизованных ферментов или клеток микроорганизмов, предварительно получаемых химическим путем.

Промышленное производство аминокислот микробиологическим способом стало возможным после открытия способности у некоторых микроорганизмов вы­делять в культуральную среду определенные количества какой-либо одной аминокислоты (С. Киносита, 1955). При этом было подме­чено, что большинство из нескольких тысяч проанализированных диких штаммов микроорганизмов если и продуцировали аминокислоты во внешнюю среду, то в очень незначительных количествах. Это не удивительно, поскольку аминокислоты являются важнейшими промежуточными метаболитами в синтезе белков, а в избыточных количествах токсичны для продуцирующих клеток. Поэтому их синтез в клетках бактерий подчиняется принципу жесткой экономии внутриклеточных ресурсов и оптимизирован в процессе эволюции. Избыточное накопление аминокислот в клетках возможно только в условиях нарушения нормального метаболизма, т.е. нахождения клеток продуцента в состоянии идиофазы. Поэтому, формально являясь первичными метаболитами, промышленно получаемые аминокислоты фактически являются вторичными метаболитами. Не зафиксировано никакой связи между таксономическим положе­нием микроорганизма и способностью к продуцированию той или иной аминокислоты. Так, среди возможных продуцентов глутаминовой кислоты отмечены организмы, из которых 30 % - дрожжи, 30 % - стрептомицеты, 20 % - бактерии и 10 % - микроскопи­ческие грибы. И лишь один из обследованных штаммов микроорга­низмов — Corynebacterium glutamicumобладал способностью к сверхсинтезу глутамата. Этот штамм использовали при организации первого в мире крупномасштабного производства глутаминовой кислоты микробиологическим методом в Японии (1956). В России изыскания в области промышленного синтеза аминокислот были начаты в 50-х годах прошлого столетия по инициативе акад. А. А. Александрова.

Перспективные штаммы продуцентов постоянно улучшают по­средством селекции мутантов с измененной генетической про­граммой и регуляторными свойствами. Для получения мутантных штаммов используют как традиционные методы селекции и мутагенеза, так и методы генной инженерии. Распространенные объек­ты селекции продуцентов — микроорганизмы, относящиеся к родам Brevibacterium, Micrococcus, Corynebacterium, Arthrobacter.

Разработка технологической схемы получения той или иной отдельной ами­нокислоты должно базироваться на максимально точном знании путей и механизмов регуляции ее биосинтеза. Необходимого дисбаланса метаболизма, обеспечивающего сверхсинтез целевого продукта, добиваются путем строго контролируемых изменений состава среды и условий культивирования.

Производство лизина.По содержанию лизина наименее сбаланси­рованы белки злаковых культур, у которых его дефицит составляет от 20 до 50 %. На территории России недостаток лизина в кормах не может быть восполнен за счет сои, поэтому в нашей стране произ­водство этой аминокислоты было организовано первым. Для удовле­творения потребностей животноводства в лизине крупнотоннаж­ное производство налажено в Испании, Франции, Японии и США.

В клетках микроорганизмов лизин синтезируется из аспарагиновой кислоты и служит конечным продуктом разветвленного ме­таболического пути биосинтеза, общего для трех аминокислот - лизина, метионина и треонина. При этом образование лизина и треонина в клетке бактерии находится под строгим метаболическим контролем. У типичных продуцентов L-лизина — Brevibacterium flavum и Corynebacterium glutamicum - фермент аспартаткиназа, открывающий метаболический путь, является уникальным аллостерическим белком, чувствительным к ингибированию по прин­ципу обратной связи при одновременном связывании аллостерического центра с молекулами L-треонина и L-лизина. При одновременном накоплении тре­онина и лизина в избыточной концентрации аспартаткиназа ингибируется и их синтез останавливается, при понижении концен­трации любой из двух аминокислот процесс активизируется.

 

 

 

Для того, чтобы добиться избыточного накопления в клетке целевой аминокислоты (лизина) используют два основных подхода.

Первый подход основан на использовании мутантных штаммов, у которых не синтезируется или не функционирует фермент - гомосериндегидрогеназа, в результа­те у них блокирован синтез треонина и метионина, т.е. одной из аминокислот ингибирующей совместно с лизином аспартаткиназу. Поскольку обойтись без этих двух аминокислот клетки не могут, то такие мутанты являются ауксотрофами по треонину и метионину, т.е. для их нормального выращивания необходимо добавлять готовый метионин и треонин в питательную среду. Если добавлять эти аминокислоты в небольших (лимитирующих) количествах, достаточных только для восполнения минимальных потребностей клеток, то внутриклеточная концентрация треонина будет у них существенно ниже той, что вызывает блокаду с аспартаткиназы. Поэтому при любых высоких концентрациях лизина в клетке ингибирования аспартаткиназы не будет. Таким образом, можно добиться сверхсинтеза лизина в количествах многократно превышающих потребности клеток-продуцентов..

Второй подход основан на использовании мутантных штаммов у которых имются дефекты в структурном гене, определяющем конформацию аспартаткиназы. Такой фермент теряет чувствительность к высоким концентрациям своего аллостерического ингибитора — лизина и эффект ретроингибирования не проявляется.

Как уже отмечалось, в избыточных количествах аминокислоты токсичны для продуцирующих их клеток. Поэтому, важным фактором, обеспечивающим их максимальный сверхсинтез, является создание условий для максимально возможного и быстрого их выведения (секреции) из клеток в культуральную среду, а так же и из самой культуральной среды. Увеличение секреции достигается обычно увеличением проницаемости клеточных мембран. Практически, проницаемость кле­точной мембраны увеличивают либо с помощью мутаций, либо путем изменения состава питательной среды. В последнем случае в культуральной среде создают дефицит биотина (1 — 5 мкл/л), до­бавляют пенициллин (2 - 4 мкг/л), детергенты (твин-40 и твин-60) или производные высших жирных кислот (пальмитаты, стеараты). Биотин контролирует содержание в клеточной мембране фосфолипидов, а пенициллин нарушает биосинтез клеточных сте­нок бактерий, что повышает выделение аминокислот в среду. Удаление аминокислот из культуральной жидкости в процессе культивирования (без остановки процесса) достигается ее отбором и пропусканием через колонку с соответствующими сорбентами, обычно ионообменными смолами. Иногда в среду для культивирования добавляют нетоксичные вещества, которые взаимодействуют с молекулами аминокислот и переводят их в нерастворимое состояние (в осадок). Часто проводят и процедуру коррекции величины рН среды, поскольку накопление больших количеств аминокислоты может сильно отклонить ее от оптимального значения.

Для культивирования штаммов микроорганизмов при произ­водстве аминокислот как источники углерода наиболее доступны углеводы - глюкоза, сахароза и реже фруктоза и мальтоза. Для снижения стоимости питательной среды в качестве источников углерода используют вторичное сырье: свекловичную мелассу (маточный раствор после выделения кристаллов сахара в процессе упаривания сахарсодержащих жидкостей), молочную сыворотку, гидролизаты крахмала, сульфитные щело­ка. Технология этого процесса совершенствуется в направлении разработки дешевых синтетических питательных сред на основе уксусной кислоты (до 1,5%), пропионовой кислоты, метанола, этанола (до 1 %) и н-парафинов. В качестве источников азота при­меняют мочевину и соли аммония (сульфаты и фосфаты). Для ус­пешного развития микроорганизмы нуждаются в стимуляторах роста, в качестве которых выступают экстракты кукурузы, дрож­жей и солодовых ростков, гидролизаты отрубей и дрожжей, вита­мины группы В. Кроме того, в питательную среду добавляют не­обходимые для жизнедеятельности макро- и микроэлементы (Р, Са, Mg, Mn, Fe и др.). На процесс биосинтеза аминокислот суще­ственное влияние оказывает снабжение воздухом, при этом сте­пень аэрации индивидуальна для производства каждой конкрет­ной аминокислоты.

Опыты показали, что лизин появ­ляется в культуральной среде начиная с середины экспоненци­альной фазы роста культуры клеток микроорганизма и достигает максимума к ее концу. Поэтому на первой стадии технологического процесса формируют биомассу продуцента, которую выращивают в специальных посевных аппаратах в течение суток (рН 7,0-7,2; температура 28 - 30 °С), а затем подают в производственный фер­ментер, заполненный питательной средой. Лизин начинает посту­пать в культуральную жидкость через 25-30 ч после начала фермен­тации. По завершении процесса ферментации (через 55 - 72 ч) жидкую фазу отделяют от культуры клеток микроорганизма филь­трованием и используют для выделения из нее лизина.

Высокоочищенные препараты лизина получают после фрак­ционирования фильтрата культуральной жидкости методом ионо­обменной хроматографии на катионите.

 

Производство триптофана.Триптофан достаточно часто явля­ется лимитирующим фактором питания, так как его содержание в традиционных продуктах (рыба, молоко, кормовые дрожжи) в 3 раза ниже, чем в стандартном белке.

Подобно лизину триптофан образуется в ходе разветвленного метаболического пути, поэтому для его производства используют ауксотрофных мутантов, у которых блокированы реакции, веду­щие к синтезу фенилаланина и тирозина. Однако при выращива­нии мутантных штаммов в среде с минимальной концентрацией этих аминокислот, не вызывающей регуляторных эффектов, из­быточное накопление триптофана в среде все равно не наблюдается, что объясняется особенностью процессов регуляции биосинтеза трип­тофана у микроорганизмов.

Наряду с другими ароматическими аминокислотами у микро­организмов и растений триптофан обра­зуется из метаболитов углеводного обмена - эритрозо-4-фосфата и фосфоенолпирувата.

Процесс новообразования ароматических аминокислот идет через шикимовую и хоризмовую кислоты. Метаболическим пред­шественником триптофана служит антраниловая кислота, кото­рая возникает из хоризмовой кислоты под действием антранилат-синтетазы. Образующийся триптофан оказывает ингибирующее действие на антранилатсинтетазу, поэтому для обхода метаболического контроля синтез этого фермента индуцируют ступенчатым введением предшественника - антраниловой кислоты (0,1—0,3 %), которая достаточно легко может быть получена методом химического синтеза:

В связи с этой особенностью промышленное производство трип­тофана организовано преимущественно по двухступенчатой схе­ме. На первом этапе химическим способом синтезируют антраниловую кислоту, которую с помощью энзиматической системы мутантных штаммов дрожжей Candida utilisпереводят в триптофан.

Биомассу дрожжей выращивают при температуре 30 °С в среде, содер-жащей свекловичную мелассу, мочевину и минеральные компоненты. Через сутки в ферментер вводят 5 %-й спиртовой раствор антраниловой кислоты и 50 %-й раствор мочевины, а че­рез 3 -4 ч после введения предшественника дополнительно до­бавляют источник углерода (25 %-й раствор мелассы). Антраниловую кислоту и мочевину подают через каждые 6 ч, а мелассу - через каждые 12 ч. Процесс двухступенчатой ферментации завер­шается через 144 ч и обеспечивает содержание триптофана в культуральной среде до 6 г/л.

Кроме триптофана микробиологическим способом с исполь­зованием предшественников получают гистидин, изолейцин, метионин, серии и треонин.

Менее распространены одноступенчатые технологии получе­ния триптофана на основе ауксотрофных мутантов бактерии Bacillus subtilis, осуществляемые по схеме, близкой к способу получения лизина. Длительность одноступенчатого процесса 48 ч, а концен­трация триптофана в культуральной среде составляет 10 г/л.

После сушки культуральной жидкости получают кормовой концентрат триптофана (ККТ), который включает белки, свобод­ный триптофан, витамины Вь В2 и PP. Высокоочищенные крис­таллические препараты триптофана образуются после дополнитель­ной очистки культуральной жидкости методом ионообменной хроматографии на колонке, заполненной катионитом (сорбция при рН 1,0; элюция 5%-м раствором гидроксида аммония в смеси с пропанолом-2). Элюаты кристаллизуют; кристаллы отмывают и высу­шивают. Кристаллический препарат содержит до 99 % триптофана.

Характерная особенность процессов получения аминокислот микробиоло-гическим способом, равно как и других биотехноло­гических производств, - полное использование побочных про­дуктов, что превращает большинство из них в безотходные и эко­логически чистые технологии. Например, осадок микроорга-низ­мов-продуцентов и промывные воды, содержащие ценные ингре­диенты, такие, как белки, остатки аминокислот, витаминов, ми­неральных солей и микроэлементов, высушивают и используют в качестве кормовых препаратов.

В последние годы при производстве аминокислот все шире ис­пользуют комбинированный способ, включающий биотрансформацию предшественников аминокислот, предварительно получаемых химическим путем.

При получении ряда аминокислот химико-ферментативными способами используют ферменты, принадлежащие к разным клас­сам. Эти процессы могут быть как одностадийными (конверсии), так и многостадийными. Источником ферментов для большин­ства процессов служат различные микроорганизмы. При этом могут использоваться как чистые ферментные препараты, так и клетки в различном состоянии: интактные (нерастущие), поврежденные, высушенные, замороженные, иммобилизованные и т.д.

Применение ферментов в производстве аминокислот обеспечивает стереоспецифичность процессов их синтеза, что выгодно отличает биотехнологические производства от химических.

Получение L-лизина.Процесс получения L-лизина основан на стереоспецифическом ферментативном гидролизе (конверсии) D-,L-α-амино-ε-капролактама, который сначала получают химическим путем из циклогексена.

 

При производстве лизина в водный раствор D-,L-α-амино-ε-капролактама одновременно вводят либо оба фермента, либо проводят процесс в присутствии обоих продуцентов. Процесс осуществляют при температуре 30-500С, рН 8,0-8,5 и оптимальном режиме аэрации. По окончании процесса содержание лизина в реакционной среде превышает 150г/л. Для повышения выхода продукта созданы мутантные штаммы не способные утилизировать лизин. Данная технология получения лизина широко используется в США и Японии.

 

Получение триптофана. Химико-ферментативный способ получения триптофана состоит в прямой конденсации индола, аммиака и триптофана:

 

Реакция катализируется пиридоксальзависимой триптофан-индолилазой (триптофаназой), которая обнаружена у широкого круга бактерий. Основной функцией этого фермента является разрушение избыточного триптофана, однако в зависимости от условий культивирования (отвод образующегося триптофана, избыток ПВК и аммиака) его действие может быть обращено в сторону реакции конденсации.

Химико-энзиматический способ может быть использован для полученяия самых различных аминокислот. По сравнению с микробиологическим он более специфичен, не требует процедуры очистки аминокислот от побочных продуктов, клеток и компонентов культуральной среды. Однако по стоимости сырья и ферментативных препаратов он еще уступает микробиологическому способу.

 

 








Дата добавления: 2016-01-30; просмотров: 6990; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ


Поиск по сайту:

При помощи поиска вы сможете найти нужную вам информацию, введите в поисковое поле ключевые слова и изучайте нужную вам информацию.

Поделитесь с друзьями:

Если вам понравился данный ресурс вы можете рассказать о нем друзьям. Сделать это можно через соц. кнопки выше.
helpiks.org - Хелпикс.Орг - 2014-2019 год. Материал сайта представляется для ознакомительного и учебного использования. | Поддержка
Генерация страницы за: 0.014 сек.