Приготовление посевного материала

Для приготовления посевного материала используют один из нижеприведенных способов:

1) За 1 сут до испытания тест-микроорганизм пересевают на питательную среду соответствующего состава (п.3) и инкубируют при температуре (32,5 ± 2,5) ^оС в течение 16 – 24 ч. Клетки отделяют центрифугированием в асептических условиях, надосадочную жидкость сливают, а осадок суспендируют в 10 мл стерильного раствора натрия хлорида^х). Вносят 0,05 млполученной суспензии в 10 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида. Мутность используемой суспензии должна быть (90 ± 1) % по шкале светопропускания фотометра-нефелометра при длине волны около 540 нм.

2) При определении D-биотина, кальция пантотената и никотиновой кислоты (или никотинамида) за 1сут до испытания небольшое количество исходной тест-культуры L.plantarum ВКМ В-758 (АТСС 8014) пересевают бактериологической петлей на агаризованную среду для лактобактерий (п.3.1). Инкубируют при температуре (32,5 ± 2,5) ⁰С в течение 16–24 ч. После этого культуру смывают стерильным раствором натрия хлорида и доводят содержание микробных клеток до 10⁹ КОЕ/мл по оптическому стандарту мутности. Затем переносят 0,2 мл взвеси в пробирку с 9,0 мл раствора натрия хлорида, перемешивают и используют в качестве посевного материала для внесения в основную питательную среду (пп. 4.1, 4.2 и 4.4).

Enteroccocus faecalis (faecium) ВКМ В-602 пересевают в жидкую питательную среду следующего состава:

· дрожжевой экстракт 2,0 г

· пептон 0,5г

· глюкоза 0,5 г

· натрия ацетат 0,5 г

· твин-80 0,01г

· вода очищенная до 100 мл

рН(6,8 ± 0,2).

Готовую среду разливают в пробирки по 10 мл и стерилизуют насыщенным паром под давлением в паровом стерилизаторе при температуре 120 – 121 ⁰С в течение 10–15 мин.

Последующие этапы работы проводят по той же схеме, что и для L.plantarum ВКМ В-758 (АТСС 8014).

При испытании допускается использование коммерческих сухих стандартных питательных сред известных производителей.

В работе используют только химически чистую лабораторную посуду.

Примечания.

а) Приготовление 1 % раствора натрия цитрата. В мерной колбе вместимостью 1000 мл в воде очищенной растворяют 10 г натрия цитрата и доводят объем раствора водой до метки. Раствор годен к использованию в течение 7 сут в условиях хранения при температуре 2 – 8 ⁰С.

б) Приготовление 10 % раствора кислотного гидролизата казеина (свободного от витаминов). При приготовлении среды для хранения культуры можно использовать коммерческий сухой солянокислый гидролизат казеина в соответствующем количестве или 10 % казеиновый кислотный гидролизат, для которого используют казеин размолотый.

В круглодонной колбе вместимостью 1000 мл смешивают 100 г казеина размолотого с 500 мл 20 % раствора хлористоводородной кислоты^ц). Смесь нагревают с обратным холодильником в течение 24 ч. Первые 5 – 8 ч растворения казеина нагревание проводят на кипящей водяной бане, затем на электроплитке с асбестовой сеткой. Из полученного гидролизата при пониженном давлении отгоняют хлористоводородную кислоту. К густому остатку прибавляют 300 мл воды очищенной, перемешивают и снова отгоняют до получения густого сиропа. Указанную операцию повторяют дважды. Далее растворяют оставшуюся массу в 100 мл воды, доводят рН раствора до 3,5 с помощью 30 % раствора натрия гидроксида и доводят объем раствора водой очищенной до 1000 мл. К готовому раствору прибавляют 20 г угля активированного, встряхивают в течение 1 ч, фильтруют на воронке Бюхнера с отсасыванием. Обработку углем повторяют, получают бесцветный или светло-желтый раствор, который разливают во флаконы по 100 мл, и стерилизуют насыщенным паром под давлением в паровом стерилизаторе при температуре 120 – 121 ⁰С в течение 15 мин. Хранят при температуре 2 – 8 ⁰С.

в) Приготовление 1 % раствора натрия двууглекислого. Растворяют в 100 мл воды очищенной 1 г натрия двууглекислого и хранят при температуре 2 – 8 °С не более 1 нед.

г) Приготовление раствора L-цистина и D,L-триптофана.В мерной колбе вместимостью 500 мл в 20 мл 20 % раствора хлористоводородной кислоты^ц) растворяют 1 гL-цистина и 1 г D,L-триптофана (или 0,5 г L-триптофана), нагревают до 70 – 80 ⁰С, периодически помешивая, до полного растворения аминокислот. После охлаждения объем доводят водой очищенной до метки и хранят при температуре 2 – 8 ⁰С.

д) Приготовление раствора твина-80. Растворяют 2,5г твина-80 в 25 млспирта. Хранят при температуре 2 – 8 ⁰С.

е) Приготовление раствора аденина, гуанина и урацила. По 0,2 г аденина сульфата, гуанина и урацила растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 100 млс добавлением 10 мл20 % раствора хлористоводородной кислоты^ц) при длительном нагревании на кипящей водяной бане. Послеохлаждения доводят объем водой очищенной до метки и хранят при температуре 2 – 8 ⁰С в течение 1 мес.

ж) Приготовление раствора кальция пантотената и тиамина. В мерной колбе вместимостью 100 млрастворяют 10 мгкальция пантотената и 5 мгтиамина хлорида в 25 мл25 % спирта, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и хранят при температуре 2 – 8 ⁰С в течение 2 нед.

з) Приготовление раствора рибофлавина. В мерной колбе вместимостью 200 мл растворяют 10 мгрибофлавина в небольшом количестве воды с добавлением 1 млледяной уксусной кислоты, доводят объем водой очищенной до метки. Хранят в емкости из темного стекла при температуре 2 – 8 ⁰С в течение 2 нед.

и) Приготовление раствора пара-аминобензойной кислоты (ПАБК), никотиновой кислоты и пиридоксина. Раствор готовят в 25 % спирте из расчета, чтобы в 1 мл содержалось 10 мкгПАБК, 40 мкгникотиновой кислоты и 20 мкг пиридоксина гидрохлорида. Раствор хранят при температуре 2 – 8 ⁰С в течение 2 нед.

к) Приготовление раствора солей А. Растворяют 5 гкалия фосфата однозамещенного и 5 гкалия фосфата двузамещенного в 50 мл воды очищенной.

л) Приготовление раствора солей Б. Растворяют 1 г магния сульфата, 0,05 гнатрия хлорида, 0,01 гжелеза сульфата и 0,05 гмарганца сульфата в 50 мл воды очищенной.

Растворы солей А и Б хранят при температуре 2 – 8 ⁰С.

м) Приготовление раствора рибофлавина, тиамина и D-биотина. В мерной колбе вместимостью 100 мл растворяют 20 мгрибофлавина, 10 мг тиамина хлорида и 4 мгD-биотина в 50 мл раствора 0,02 М уксусной кислоты, объем доводят водой очищенной до метки. Хранят в емкости из темного стекла при температуре 2 – 8 ⁰С.

н) Приготовление раствора L-цистина, D,L-триптофана и L-аспарагина. По 1 г L-цистина, D,L-триптофана и L-аспарагина растворяют в 200 мл воде очищенной сдобавлением 20 мл 20 % раствора хлористоводородной кислоты^ц) в мерной колбе вместимостью 500 мл, нагревают до 70 – 80 °С, периодически помешивая, до полного растворения аминокислот. После охлаждения объем раствора доводят водой до метки и хранят при температуре 2 – 8 °С.

о) Приготовление раствора аденина, гуанина, урацила и ксантина. По 0,1 г аденина сульфата, гуанина хлорида, урацила и ксантина растворяют в воде очищенной в мерной колбе вместимостью 100 мл с добавлением 10 мл 20 % раствора хлористоводородной кислоты^ц) при длительном нагревании на кипящей водяной бане. После охлаждения доводят объём водой очищенной до метки и хранят при температуре 2––8 ⁰ С.

п) Приготовление раствора тиамина, рибофлавина и никотиновой кислоты (никотинамида). По 10 мг тиамина хлорида, рибофлавина и 30 мг никотиновой кислоты растворяют приблизительно в 150 мл воды очищенной с добавлением 1 мл уксусной кислоты ледяной в мерной колбе вместимостью 250 мл, объём доводят водой очищенной до метки. Хранят в емкости из тёмного стекла при температуре 2–8 ⁰ С в течение 2 нед.

р) Приготовление раствора кальция пантотената. В мерной колбе вместимостью 100 мл растворяют 10 мг кальция пантотената в 25 мл воды очищенной, добавляют 25 мл спирта, доводят водой до метки. Хранят при температуре 2 – 8 ⁰С в течение 1 мес.

с) Приготовление раствора пиридоксина. В мерной колбе вместимостью 100 мл растворяют 10 мг пиридоксина гидрохлорида в 25 мл воды очищенной, добавляют 25 мл этилового спирта, доводят водой до метки. Хранят при температуре 2 – 8 ⁰С в течение 1 мес.

т) Приготовление раствора ПАБК.В мерной колбе вместимостью 100 мл растворяют 2мг ПАБК в 25 мл воды очищенной, добавляют 25 мл этилового спирта, доводят водой до метки и перемешивают. Хранят при температуре 2 – 8 ⁰С в течение 1 мес.

у)Приготовление раствора D-биотина. Вмерной колбе вместимостью 500мл растворяют 1мг D-биотина при нагревании на кипящей водяной бане в 200мл воды очищенной с добавлением 2мл уксусной кислоты ледяной, доводят водой до метки. Хранят при температуре 2 – 8 °С.

ф) Приготовление раствора пиридоксина и ПАБК. По 10 мг пиридоксина и ПАБК растворяют в 25 мл воды очищенной в мерной колбе вместимостью 100 мл, прибавляют 25 мл этилового спирта, доводят объем раствора тем же растворителем до метки. Хранят при температуре 2 – 8 °С не более 1 мес.

х) Приготовление раствора натрия хлорида (0,9 %) изотонического. Растворяют 2,25 гнатрия хлорида в 250 мл воды очищенной, разливают по 10–15 мл в пробирки, стерилизуют насыщенным паром под давлением в паровом стерилизаторе при температуре 120 – 121 ^оС в течение 15 мин.

ц) Приготовление 20 % раствора хлористоводородной кислоты. Разбавляют 425 мл хлористоводородной кислоты концентрированной (d = 1,19) водой очищенной до 1000 мл и перемешивают.