Выполнение испытания. Точную навеску порошка растертых драже или таблеток, указанную в соответствующих фармакопейных статьях или в нормативной документации

Точную навеску порошка растертых драже или таблеток, указанную в соответствующих фармакопейных статьях или в нормативной документации, количественно переносят водой в мерную колбу определенной вместимости, доводят объем раствора водой очищенной до метки, перемешивают и фильтруют (основной раствор).

Готовят растворы рабочих стандартных и испытуемых образцов. Для этого в 2–3 ряда пробирок одинакового размера разливают по 1 мл свежеприготовленной воды очищенной. Образцы в количестве 1 мл с концентрацией D-биотина около 0,002 мкг/мл, кальция пантотената – 0,2 мкг/мл, фолиевой кислоты – 0,004 мкг/мл, никотиновой кислоты (или никотинамида) – 0,32 мкг/мл вносят в первые пробирки соответствующих рядов и делают 6 последовательных разведений в каждом ряду, перемешивая и перенося 1млраствора в следующие пробирки ряда; из последней отбирают 1 мл и удаляют в дезинфицирующий раствор. Затем во все пробирки добавляют по 1 мл основной среды. При этом общий объем полученных растворов в каждой пробирке должен быть равен 2 мл.

В каждом ряду ставят отрицательный контроль, содержащий 1 мл воды очищенной и 1 млосновной среды.

Все пробирки стерилизуют насыщенным паром под давлением в паровом стерилизаторе при температуре 120 – 121 ⁰С в течение 10–15 мин. После охлаждения в каждую пробирку вносят по 0,1 мл разведенной взвеси тест-культуры (п.5).

Засеянные пробирки инкубируют при температуре (32,5±2,5)^оС в течение 16–24 ч. Интенсивность роста тест-культуры в пробирках стандартного и испытуемого образцов измеряют на фотометре-нефелометре при длине волны около 540 нм.

Содержание определяемого витамина в одной таблетке в граммах (X) вычисляют по формуле:

где С – среднеарифметическое содержание D-биотина в 1 мл, найденное по стандартной кривой для шести концентраций растворов испытуемого образца с учетом всех разведений (4; 8; 16; 32; 64 и 128), в мкг;

V, V₁, V₂ – разведения, мл;

а – навеска испытуемого образца в граммах или количество таблеток;

б – средняя масса одной таблетки, г;

10⁶ – коэффициент для пересчета, г.

Примечания.

Приготовление рабочих растворов СО витаминов

1. СО D-биотина. В мерную колбу вместимостью 500 мл помещают 200 мл25 % спирта, в котором растворяют 0,0010 г D-биотина на кипящей водяной бане.После охлаждения объем раствора доводят тем же растворителем до метки (основной раствор) и перемешивают. В 1 мл основного раствора содержится 2мкг D-биотина.

В мерную колбу вместимостью 50 млпомещают 5 млосновного раствора и доводят объем раствора водой очищенной до метки. Переносят 1 млполученного раствора в мерную колбу вместимостью 100 мли доводят объем раствора водой до метки (рабочий раствор). Рабочий раствор содержит 0,002 мкг D-биотина в 1 мл. Содержание D-биотина в стандартном ряду разведений должно соответствовать 0,0005; 0,00025; 0,000125; 0,0000625; 0,000031; 0,0000156 мкг/мл и 0 мкг/мл – в отрицательном контроле.

2. СО кальция пантотената. В мерной колбе вместимостью 50 мл в 25 % спирте растворяют 0,050 г кальция пантотената (в пересчете на сухое вещество по содержанию азота) и доводят объем раствора тем же растворителем до метки (основной раствор). В 1 мл основного раствора содержится 1 мг кальция пантотената.

В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 1 мл основного раствора и доводят объем раствора водой очищенной до метки. Переносят 1 млполученного раствора в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объем раствора водой очищенной до метки (рабочий раствор). Рабочий раствор содержит 0,2 мкг кальция пантотената в 1 мл. Содержание кальция пантотената в стандартном ряду разведений должно соответствовать 0,05; 0,025; 0,0125; 0,00625; 0,0031; 0,00156 мкг/мл и 0 мкг/мл – в отрицательном контроле.

3. СО фолиевой кислоты. В мерной колбе вместимостью 100 мл в 5 мл 1 % раствора натрия двууглекислого^в) растворяют 0,0100 г фолиевой кислоты, доводят объем водой очищенной до метки (основной раствор). В 1 мл основного раствора содержится 100 мкг фолиевой кислоты.

В мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 1 мл основного раствора и доводят объём раствора водой очищенной до метки. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 1 мл полученного раствора, доводят объём раствора водой очищенной до метки.

10 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл (рабочий раствор). Рабочий раствор содержит 0,004 мкг фолиевой кислоты в 1 мл.

Содержание фолиевой кислоты в стандартном ряду при приготовлении разведений должно соответствовать 0,001; 0,0005; 0,00025, 0,000125; 0,0000625; 0,00003125 мкг/мл и 0 мкг/мл – в отрицательном контроле.

4. СО никотиновой кислоты (или никотинамида). В мерной колбе вместимостью 100 мл в 25 % спирте растворяют 0,0100 г никотиновой кислоты (или никотинамида) и доводят объем раствора тем же растворителем до метки (основной раствор). В 1 мл основного раствора содержится 100 мкг никотиновой кислоты или никотинамида. Раствор хранят при температуре 2 – 8 ⁰ С не более 1 мес.

В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 2 мл основного раствора и доводят объем раствора водой очищенной до метки. 4 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора водой до метки. Рабочий раствор содержит 32 мкг/мл никотиновой кислоты или никотинамида.

Содержание кислоты никотиновой или никотинамида в стандартном ряду разведений должно соответствовать 0,08; 0,04; 0,02; 0,01; 0,005 мкг/мл и 0 мкг/мл – в отрицательном контроле.

Растворы годны к использованию в течение 2–3 мес при хранении в емкости с притертой пробкой при температуре 2 – 8 °С.

2. Построение стандартной кривой. На оси абсцисс откладывают содержание определяемого витамина (в мкг/мл) в пробирках стандартного ряда, а на оси ординат – соответствующие им значения процента светопропускания. По полученным точкам вычерчивают стандартную кривую, находят концентрацию соответствующих витаминов в мкг/мл и вычисляют их содержание в образце.

3. Хранение и подготовка тест-культуры для анализа

3.1. L. plantarum ВКМ В-578 (АТСС 8014)поддерживают на питательной среде следующего состава:

· дрожжевой экстракт 2,0 г

· пептон 0,5 г

· глюкоза 0,5 г

· натрия ацетат 0,5 г

· твин-80 0,01 г

· агар микробиологический 1,6 г

· вода очищенная до 100 мл

рН (6,8 ± 0,2)

3.2. Е. faecalis ВКМ В-602поддерживают на питательной среде следующего состава:

· дрожжевой экстракт 1,0 г

· глюкоза 0,5г

· натрия ацетат 0,5 г

· агар микробиологический 1,8 г

· вода очищенная до 100 мл

рН (6,8 ± 0,2).

Ингредиенты последовательно растворяют в воде, устанавливают требуемое значение рН 6,8 и доводят объем водой очищенной до 100 мл. Смесь нагревают при перемешивании на кипящей водяной бане до полногорастворения агара,разливают по 5 мл в пробирки, стерилизуют насыщенным паром под давлением в паровом стерилизаторе при температуре 120 – 121 ⁰ С в течение 10–15 мин, охлаждают в наклонном положении для получения скошенной поверхности агара.

Посевы инкубируют при температуре (32,5 ± 2,5) ⁰С в течение 16–24 ч. Тест-культуру хранят при температуре 2 – 8 ⁰С, пересевая не реже одного раза в мес.

Примечания.

Состав и приготовление основной среды

1. Состав среды для определения содержания D-биотина:

· глюкоза 40 г

· натрия ацетат 20 г

· раствор гидролизата казеина 10% 100 мл^б)

· раствор L-цистина и D, L-триптофана 100мл^г)

· раствор твина-80 1 мл^д)

· раствор аденина, гуанина и урацила 10 мл^е)

^· раствор кальция пантотената и тиамина 20 мл^ж)

^· раствор рибофлавина 40 мл^з)

· раствор ПАБК, пиридоксина, никотиновой кислоты 20 мл^и)

· растворы солей А^к) и солей Б^л) по 10 мл

· вода очищенная до 1000 мл

рН (6,8 ± 0,2)

2. Состав среды для определения содержания кальция пантотената:

· глюкоза 40 г

· натрия ацетат 20 г

· раствор гидролизата казеина^б) 100 мл

· раствор L-цистина и D, L-триптофана^г) 100 мл

· раствор твина-80^д) 1 мл

· раствор аденина, гуанина, урацила^е) 20 мл

· раствор рибофлавина, тиамина, D-биотина^м) 20 мл

· раствор ПАБК, пиридоксина, никотиновой кислоты^и) 20 мл

· растворы солей А^к) и солей Б^л) по 20 мл

· вода очищенная до 1000 мл

рН (6,8 ± 0,2)

3. Состав среды для определения содержания фолиевой кислоты:

· глюкоза 40 г

· натрия цитрат ^а) 20 г

· раствор гидролизата казеина^б) 120 мл

· раствор L-цистина, D,L-триптофана, L-аспарагина^н) 100мл

· раствор аденина, гуанина,урацила и ксантина ^о) 10мл

· раствор тиамина, рибофлавина, никотиновой кислоты ^п) 10мл

· раствор кальция пантотената ^р) 8мл

· раствор пиридоксина ^с) 24мл

· раствор ПАБК^т) 10 мл

· раствор биотина ^у) 0,5 мл

· раствор солей Б^л) 10 мл

· вода очищенная до 1000 мл

рН (6,8 ± 0,2).

4. Состав среды для определения содержания никотиновой кислоты (никотинамида):

· глюкоза 40 г

· натрия ацетат 20 г

· раствор гидролизата казеина^б) 100 мл

· раствор аденина, гуанина, урацила^е) 10 мл

· раствор L-цистина и D, L-триптофана^г) 100 мл

· раствор тиаминаи кальция пантотената ^ж) 2 мл

· раствор рибофлавина ^з) 8 мл

· раствор пиридоксина и ПАБК ^ф) 2 мл

· раствор биотина ^у) 4 мл

· растворы солей А^к) и солей Б^л) по 10 мл

· вода очищенная до 1000 мл

рН (6,8 ± 0,2)

5. Приготовление питательных сред для определения содержания витаминов. Глюкозу предварительно обрабатывают углем активированным осветляющим. Для этого к 200 мл20 % раствора глюкозы добавляют 10 гугля, встряхивают в течение 40 мини фильтруют через плотный бумажный фильтр. К раствору глюкозы добавляют остальные растворы, устанавливают рН 6,8 и доводят объем среды водой очищенной до 1000 мл. Среду нагревают на кипящей водяной бане 5 мин, охлаждают и фильтруют через бумажный фильтр. Готовую среду разливают по 70 мл в колбы вместимостью 100 мл, закрывают и хранят в морозильной камере при температуре минус 18 – 25 ⁰ С в течение 3 мес. Перед использованием среду размораживают при комнатной температуре.