Определение водорастворимых витаминов
Все водорастворимые витамины (за исключением витамина С в некоторых случаях) определяют методом ВЭЖХ (см. раздел «Определение жирорастворимых витаминов», пункт 1).
1. Определение витаминов В1, В2, В3, В6, ВС, С и рутина
Рекомендуемые концентрации витаминов в стандартном и испытуемом растворах:
Витамин В1 – от 5 до 15 мкг/мл;
Витамин В2 – от 3 до 8 мкг/мл;
Витамин В3 (никотинамид и никотиновая кислота) – от 2 до 5 мкг/мл;
Витамин ВС (фолиевая кислота) – от 3 до 8 мкг/мл;
Витамин В6 – от 5 до 10 мкг/мл;
Витамин С – от 150 до 300 мкг/мл;
Рутин – от 100 до 200 мкг/мл.
Приготовление подвижной фазы
Раствор А. Около 0,240 г (точная навеска) натрия пентансульфоната и 5 мл уксусной кислоты ледяной растворяют в смеси метанол – вода (25:75), переносят в мерную колбу вместимостью 250 мл, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают.
Раствор Б. Около 0,275 г (точная навеска) натрия гептансульфоната и 5 мл уксусной кислоты ледяной растворяют в смеси метанол – вода (25:75), переносят в мерную колбу вместимостью 250 мл, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают.
Для получения подвижной фазы смешивают растворы А и Б в соотношении 5:3.
Приготовление стандартного раствора. В зависимости от состава анализируемого препарата готовят стандартный раствор витаминов рассматриваемой группы, содержащихся в этом препарате. Точные навески стандартных образцов витаминов В1, В2, В6, никотинамида, Вс (фолиевой кислоты), С, рутина, примерно равные содержанию этих витаминов в 1 таблетке (капсуле, дозе) анализируемого препарата, помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляют 20 мл подвижной фазы, нагревают в течение 20 мин на водяной бане при 60 °С, охлаждают до комнатной температуры, доводят объем раствора подвижной фазой до метки и перемешивают.
Приготовление испытуемого раствора. Растирают 10 таблеток (содержимое 10 капсул) и отбирают точную навеску порошка, примерно равную массе одной таблетки или содержимого одной капсулы. При анализе жидких или гелеобразных образцов берут точную навеску, примерно равную массе одной дозы препарата. навеску помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл. Далее поступают, как при приготовлении стандартного раствора, начиная со слов «добавляют 20 мл подвижной фазы». При необходимости используют другое разведение для получения приемлемых для конкретных условий анализа концентраций витаминов.
Проведение анализа. Последовательно хроматографируют предварительно отфильтрованные через фильтр с размером пор 0,5 мкм стандартный и испытуемый растворы, проводя детектирование при 280 нм. Операцию повторяют не менее двух раз.
1.1. Определение рутина отдельно от других
водорастворимых витаминов
Для уменьшения времени удерживания рутина используют подвижную фазу состава метанол – вода (44,5:55,5) с рН 2,4 (рН устанавливают, добавляя по каплям фосфорную кислоту разведенную 10 %. Остальные операции проводят аналогично разделу «Определение водорастворимых витаминов» (пункт 1) с той разницей, что нагревание на водяной бане при 60 °С проводят в течение 5 мин. Время удерживания рутина около 6 мин, детектирование при длине волны 360 нм.
2. Определение витамина В5
Подвижная фаза: калия дигидрофосфата 0,05 М раствор (рН 2,8) – метанол (95:5).
Приготовление стандартного раствора. Готовят раствор стандартного образца витамина В5 (пантотеновой кислоты, пантотената кальция или пантенола) в подвижной фазе с концентрацией около 200 мкг/мл в расчете на пантотеновую кислоту.
Приготовление испытуемого раствора. Точную навеску порошка растертых таблеток (содержимого капсул, жидкого или гелеобразного препарата), эквивалентную 10 мг витамина В5, помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляют 20 мл подвижной фазы, встряхивают 2 – 3 мин, доводят объем раствора подвижной фазой до метки и перемешивают.
Перед проведением анализа стандартный и испытуемый растворы фильтруют через фильтр с размером пор 0,5 мкм.
Проведение анализа. Последовательно хроматографируют стандартный и испытуемый растворы, проводя детектирование при 205 нм. Остальные условия указаны в пункте 1. Операцию повторяют не менее двух раз. Время удерживания витамина В5 около 8,5 мин.
3. Определение витамина В12
Методика 1
подвижная фаза: метанол –вода (35:65).
Приготовление стандартного раствора. Готовят раствор стандартного образца цианокобаламина в воде, имеющий концентрацию около 0,5 мкг/мл.
Приготовление испытуемого раствора. Растирают 10 таблеток (содержимое 10 капсул) и отбирают точную навеску порошка, эквивалентную примерно 10 мкг цианокобаламина (при анализе жидких или гелеобразных образцов отбирают точный объем или берут точную навеску, в которых содержание цианокобаламина примерно равно его содержанию в одной дозе препарата). Навеску помещают в коническую колбу вместимостью 50 мл, добавляют 20,0 мл воды и энергично встряхивают в течение 2 – 3 мин. Раствор фильтруют через фильтр с размером пор 0,5 мкм, отбрасывая первые 5 мл фильтрата (в случае жидких образцов раствор тщательно перемешивают).
Проведение анализа. Инжектируемый объем не менее 50 мкл. Остальные условия указаны в пункте 1. Последовательно хроматографируют стандартный и испытуемый растворы, проводя детектирование при 550 нм. Операцию повторяют не менее 2 раз. Время удерживания витамина В12 около 5 мин.
Методика 2
подвижная фаза: динатрия гидрофосфата безводного раствор 1 % (рН 3,5) – метанол (70:30).
Приготовление стандартного раствора. Готовят раствор стандартного образца цианокобаламина в воде с концентрацией около 0,5 мкг/мл.
Приготовление испытуемого раствора. Растирают 10 таблеток (содержимое 10 капсул) и отбирают точную навеску порошка, эквивалентную примерно 10 мкг цианокобаламина (при анализе жидких или гелеобразных образцов отбирают точный объем или берут точную навеску с содержанием цианокобаламина, примерно равным его содержанию в одной дозе препарата). Добавляют 20,0 мл подвижной фазы и встряхивают в течение 5 мин. Полученный раствор фильтруют через фильтр с размером пор 0,5 мкм, отбрасывая первые 5 мл фильтрата (в случае жидких образцов раствор тщательно перемешивают).
Проведение анализа. Инжектируемый объем не менее 50 мкл. Остальные условия указаны в пункте 1. Последовательно хроматографируют стандартный и испытуемый растворы, проводя детектирование при 361 нм. Операцию повторяют не менее двух раз. Время удерживания витамина В12 около 5 мин.
Методика 3
определение методом спектрофотометрии. Готовят раствор препарата в воде с концентрацией 20 – 25 мкг/мл. Измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре в максимуме поглощения при длине волны 361 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.
Параллельно измеряют оптическую плотность раствора стандартного образца цианокобаламина.
В качестве раствора сравнения используют воду.
При анализе инъекционных растворов содержание цианокобаламина (X) в 1 мл препарата в микрограммах вычисляют по формуле:
| X = | A ∙ a0 ∙ N ∙ 106 | , |
| A0 ∙ V |
где: А – оптическая плотность испытуемого раствора;
А0 – оптическая плотность раствора стандартного образца цианокобаламина;
а0 – навеска стандартного образца цианокобаламина (в пересчете на 100 % вещество), г;
N – разведение;
V – объем препарата, взятый для анализа, мл.
При анализе субстанций содержание цианокобаламина (Х) в субстанции в процентах вычисляют по формуле:
| X = | A ∙ C0 ∙ N ∙ 100 | , |
| A0 ∙ a |
где: А – оптическая плотность испытуемого раствора;
А0 – оптическая плотность раствора стандартного образца цианокобаламина;
С0 – концентрация раствора стандартного образца цианокобаламина (в пересчете на 100 % вещество), г/мл;
а – навеска цианокобаламина (в пересчете на 100 % вещество), г;
N – разведение испытуемой субстанции.
Примечания.
1. Приготовление раствора стандартного образца цианокобаламина.
Около 0,05 г (точная навеска) стандартного образца цианокобаламина помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 80 мл воды, взбалтывают 10 мин, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают (раствор А). 2,0 мл полученного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.
Срок годности раствора А при хранении в защищенном от света месте 1 мес.
2. При отсутствии стандартного образца цианокобаламина можно использовать значение удельного показателя поглощения цианокобаламина при длине волны 361 нм, равное 207.
4. определение d-биотина
Приготовление подвижной фазы. К 1,0 г натрия перхлората прибавляют 75 мл ацетонитрила и 1 мл фосфорной кислоты; после растворения добавляют воду до объема 1 л и доводят значение рН до 4,5 добавлением натрия гидроксида раствора 0,1 М.
Приготовление стандартного раствора. Готовят раствор стандартного образца d-биотина, имеющий концентрацию около 3 мкг/мл.
Приготовление испытуемого раствора. Растирают 10 таблеток (содержимое 10 капсул) и отбирают точную навеску порошка, примерно эквивалентную 75 мкг d-биотина. Аналогичную навеску берут при анализе жидких или гелеобразных образцов. Навеску помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляют 15 мл воды, нагревают на водяной бане при 60 °С в течение 5 мин, охлаждают до комнатной температуры, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.
Перед проведением анализа стандартный и испытуемый растворы фильтруют через фильтр с размером пор 0,5 мкм.
При анализе субстанции биотина испытуемый раствор готовят так же, как стандартный раствор.
Проведение анализа. Последовательно хроматографируют стандарт-ный и испытуемый растворы на колонке 250 ´ 4,6 мм, заполненной октилсилилсиликагелем с размером частиц 5 мкм, проводя детектирование при 200 нм. Остальные условия указаны в п. 1. Операцию повторяют не менее трех раз. Время удерживания d-биотина около 20 мин.
5. Титриметрическое определение витамина С
Растирают 10 таблеток (содержимое 10 капсул) и отбирают точную навеску порошка, примерно эквивалентную 0,1 г аскорбиновой кислоты. При анализе жидких или гелеобразных образцов берут аналогичную навеску. Навеску помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 10 мл воды очищенной и 10 мл хлористоводородной кислоты 2 %, встряхивая в течение 10 мин. Объем полученного раствора доводят водой до метки, перемешивают и фильтруют; первые 10 мл фильтрата отбрасывают. 10,0 мл полученного раствора помещают в коническую колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 1 мл хлористоводородной кислоты 2 %, 0,5 мл калия йодида раствора 1 %, 2 мл крахмала раствора 0,5 %, воду до общего объема 20 мл и титруют раствором калия йодата 0,00167 М до появления стойкого светло-синего окрашивания.
Параллельно проводят контрольный опыт.
1 мл калия йодата раствора 0,00167 М соответствует 0,8824 мг С6Н8О6 (аскорбиновой кислоты).
Дата добавления: 2016-01-30; просмотров: 1441;