Регуляция экспрессии генов

О проблеме регуляции экспрессии генов мы в этой книге говорим фактически во всех главах, рассматривая ее с разных сторон. Существует такое, может быть несколько одностороннее, определение развития: «Понять развитие – это значит объяснить, почему гены в клетках зародыша работают в нужное время и в нужном месте». Говоря о регуляции экспрессии генов, мы можем говорить о нескольких уровнях пли этапах этого процесса.

Первым таким уровнем являются события, которые происходят на хромосоме, т. е. те процессы, которые определяют и регулируют транскрипцию. Здесь мы рассмотрим новые данные, которые сейчас получены о строении регуляторных участков гена, так называемых промоторов. Кроме того, мы обсудим взаимоотношения ДНК с теми белками хроматина, которые создают организацию хромосомы и определяют включение определенных генов.

Вторым уровнем регуляции экспрессии генов можно считать события, происходящие в ядре с уже транскрибированной молекулой про‑мРНК, т. е. процессинг и транспорт мРНК из ядра в цитоплазму. Регуляция на этом уровне, как считают некоторые исследователи, так же важна, как на уровне транскрипции, но механизмы ее почти совершенно неизвестны.

Молекула мРНК не обязательно сразу присоединяется к рибосоме и начинает транслироваться. Часто мРНК сначала образуют комплексы с белками – информосомы, которые служат как бы депо для мРНК, и выход из этого депо может служить механизмом регуляции экспрессии, который в процессах развития играет особенную роль.

Наконец, сам процесс трансляции тоже может быть местом регуляции экспрессии генов, и это выражается не только в изменении скорости синтеза белка, но иногда и в быстрой смене состава транслируемых мРНК. Наконец, когда белок уже синтезирован и даже занял в клетке свое место, это еще не означает, что проявление действия гена неизбежно. При недостатке субстрата признак – если это продукт реакции, катализируемой ферментом, – не проявится.

Промоторы генов

В этом разделе мы кратко расскажем о том, какие нуклеотидные последовательности, прилегающие к генам, а иногда и внутри гена, ответственны за процесс транскрипции. У прокариот эти участки, с которыми связывается молекула РНК‑полимеразы и откуда начинается считывание, известны уже давно и хорошо. Они называются промоторами. Для эукариот сведения о промоторах были получены совсем недавно. Для этого использовали два метода. По одному из них гены изолировали путем клонирования, а затем с помощью специальных ферментов – рестриктаз – из них вырезали кусочки ДНК с одного или с другого конца гена или даже посередине. В последнее время исследователи пошли еще дальше и научились искусственно комбинировать гены – «пришивать» регуляторный район одного гена к структурной части другого. После этого способности таких реконструированных генов к эффективной и правильной транскрипции проверяли в пробирке или помещая эти ДНК в ядро ооцита.

Второй метод состоит в том, что последовательность нуклеотидов в частях ДНК, прилегающих к гену, исследуется у возможно большего числа разных генов. У них обнаруживаются сходные (гомологичные) последовательности, расположенные на некотором расстоянии от стартовой точки, с которой начинается транскрипция. Эти гомологичные последовательности и рассматривают как потенциальные промоторные участки или, во всяком случае, как участки, имеющие отношение к регуляции работы генов. При таком методе анализа должны, однако, ускользать те регуляторные последовательности ДНК, которые у разных генов не одинаковые, а различные и которые, очевидно, ответственны за специфическую регуляцию работы генов – индивидуальную для каждого из них.

Для обозначения места, занимаемого нуклеотидом в области начала считывания и промоторов, принят такой порядок. Тот нуклеотид, с которого начинается считывание (стартовая точка), обозначается +1, следующий (его помещают правее) – +2, +3 и т. д. Нуклеотид, предшествующий стартовой точке (левее ее), не считывается РНК‑полимеразой и его обозначают –1. Следующий перед ним –2, затем в направлении, обратном считыванию, идут –3, –4 и т. д.

Сегодня показано, что в положении +1 почти всегда стоит А, а вслед за ним идет четыре‑пять пиримидиновых нуклеотидов, т. е. T или Ц. Если этот порядок нуклеотидов нарушить, то транскрипция пойдет неправильно, т. е. начнется не со стартовой точки, а по соседству с ней. Если теперь посмотреть назад (налево), на нуклеотиды, которые не должны считываться, то у бактерий в положении – 10 находится так называемая Прибнов‑последовательность (по имени автора): ТАТААТА. Очевидно, это то место, на которое «садится» молекула бактериальной РНК‑полимеразы, и в этом случае активный центр фермента, который собственно и начинает транскрипцию, окажется в районе стартовой точки.

У структурных генов эукариот в положении –10 ничего подобного нет, но зато очень похожая последовательность была обнаружена в районе –30 (у разных генов это место варьирует от –29 до –33). Эта последовательность выглядит, как ТАТА и по имени обнаруживших ее ученых названа Голдберг – Хогнесс‑последовательность, или, короче, «ТАТА‑бокс». Нарушение этой последовательности или ее изъятие приводит к замедлению транскрипции (она реже начинается) и, главное, к неправильному считыванию, т. е. к изменению стартовой точки на несколько нуклеотидов вперед или назад.

Можно думать, что РНК‑полимераза, которая у эукариот по размеру больше, чем бактериальная, занимает больший участок на ДНК. Между ее «центром узнавания», который присоединяется к ТАТА‑последовательности, и «активным центром», который должен находиться над стартовой точкой, расстояние равно длине в 30 пар нуклеотидов (~10 нм). Для бактериального фермента это расстояние втрое меньше.

Te участки ДНК, о которых мы здесь рассказали, не представляют принципиального интереса, так как они определяют лишь точность стартовой точки. Ими нельзя объяснить, почему один ген работает, а другой нет. Поэтому большее внимание сейчас уделяется участкам, которые располагаются еще дальше от стартовой точки, чем «ТАТА‑бокс». И действительно, у эукариот в районе от –70 до –80 нуклеотидов находится область с похожей последовательностью у разных генов. Роль этого участка пока не установлена. Может быть, более интересно, что скорость транскрипции сильно меняется (модулируется) в зависимости от наличия участка, располагающегося па расстоянии от –80 до –200 нуклеотидов от стартовой точки. Там, хочется думать, и находится регуляторный участок гена, к которому присоединяется регуляторный белок и уменьшает или увеличивает активность гена.

Сейчас уже накапливаются данные о последовательности нуклеотидов в этих регуляторных участках, которые называют модуляторами или энхансерами (усилителями). Пока не очень ясно, насколько строго должна соблюдаться такая последовательность. По одним данным, даже значительные ее изменения оказывают небольшой эффект, по другим – замена всего одной пары нуклеотидов увеличивает (или уменьшает) активность гена во много раз. Неясно и следующее. Никакой белок, даже самый длинный, не может протянуться на 100 и более нуклеотидов. Следовательно, остается не так много возможностей. Либо регуляторный белок действует на стартовую точку на расстоянии, либо молекула ДНК в этом районе сложена так, что регуляторный белок оказывается вблизи РНК‑полимеразы и может контролировать ее поведение. Сейчас обсуждается и такая идея: модуляторный участок – это то место в районе гена, где РНК‑полимераза может присоединиться к ДНК. Далее она уже легко «проскальзывает» до ТАТА‑участка и точно со стартовой точки начинает транскрипцию,

Белки хроматина

Мы уже знаем, что хроматин состоит из ДНК и гистонов в равном весовом количестве и негистоновых белков (НГБ), которых в неактивных районах хромосомы всего 0,2 веса ДНК, а в активных – более чем 1,2 (в среднем НГБ мепьше, чем ДНК). Мы знаем также, что гистоны вместе с ДНК образуют нуклеосомы, и роль гистонов. очевидно, должна быть прежде всего структурная – поддерживать нуклеосомную организацию ДНК и также создавать высшие уровни ее укладки. Ho если роль гистонов так пассивна, почти механическая, то чем объяснить, что существуют варианты гистонов, которые синтезируются на разных стадиях развития морского ежа? Почему гистона H1 заметно меньше в активно работающих генах? Чем также объяснить химические модификации гистонов: перед образованием митотических хромосом в гистонах возрастает число присоединенных к ним фосфатных групп, а перед началом активной транскрипции – число ацетильных групп?

Все эти факты показывают, что гистоны играют существенную роль не только в организации хроматина, но и в происходящей на нем транскрипции. С гистонами или, точнее, с характером их связи с ДНК связана такая важная особенность ДНК, как ее повышенная чувствительность к действию нуклеаз (ферментов, разрывающих нить ДНК) именно в активных генах или в генах, готовых начать свою функцию. Похоже, что ДНК в районе таких генов менее связана с гистонами, более доступна атаке ферментов.

Негистоновые белки хроматина (НГБ) – очень разнородная группа белков, но каждый из них представлен в небольшом количестве. Выше уже рассказывалось, как новая техника использования антител против различных белков хроматина и флюоресцентных красителей позволила различить по меньшей мере две группы НГБ с различными свойствами и локализацией. Одни НГБ располагаются вдоль всей хромосомы – вероятно, это НГБ, связанные со структурой хромосом. Другие НГБ располагаются дискретно и связаны с отдельными генами. Они‑то и могут быть специфически регулирующими белками, определяющими работу отдельных генов.

Часть НГБ, очевидно, играет такую же структурную роль, как и гистоны. Например, есть группа белков хроматина, которые движутся в электрофорезе быстрее других. Их так и называют – «быстродвижущаяся группа» (БДГ, или, по‑английски, HMG). По своему строению и составу аминокислот они напоминают гистоны и, возможно, когда‑то произошли от них. Оказалось, что некоторые белки БДГ, а именно БДГ‑14 и БДГ‑17 преимущественно располагаются в районах активно работающих генов. Их функция, очевидно, не только структурная.

Итак, разнообразие НГБ, аналогия с прокариотами, у которых функции регуляции осуществляют негистоновые белки, и монотонность расположения гистонов вдоль всех ДНК позволяют думать, что именно среди НГБ и следует искать специфические регуляторы транскрипции. Поэтому в большинстве схем включения и выключения генов, которые фигурируют сегодня в литературе, специфическая роль отводится именно НГБ. Это не означает, что гистоны никак не участвуют в транскрипции, но им обычно отводится неспецифическая роль.

Гены могут находиться по меньшей мере в трех состояниях: неактивном и не подготовленном к активации, неактивном, но готовом к активации (компетентном) и, наконец, в активном, работающем состоянии. В действительности различных состояний, вероятно, больше, например гены могут транскрибироваться с большей или меньшей активностью. Участки хромосом, не готовые к активации, часто образуют плотно компактизованные (спирализованные) глыбки гетерохроматина. Возможно, что гетерохроматинизация создается гистонами, например их фосфорилированием. Ho для этого необходимо, чтобы гистоны были изменены именно в данном типе клеток и только в данном участке хромосомы: в других клетках эти гены могут оказаться как раз активными. А для такой строгой локализации необходимы белки, способные не только изменить гистоны (например, фосфорилировать их), но и отличить один участок хромосомы от других, т. е. в конечном счете отличить одну последовательность ДНК от другой. Такими способностями могут, очевидно, обладать только высокоспецифичные негистоновые белки.

В клетках, компетентных к включению определенных генов, эти гены должны как‑то отличаться от тех, которые к включению не готовы. Так, например, стероидные гормоны вызывают включение генов только в компетентных клетках, причем в разных клетках‑мишенях они включают различные гены (см. гл. 7). Полагают, что с «компетентными» генами связан особый белок‑акцептор, способный связаться с гормон‑рецепторным комплексом. Такие акцепторные белки должны быть достаточно специфичны, у них две задачи: опознать последовательность в ДНК, чтобы найти тот ген, который они сделают компетентным, а затем опознать гормон‑рецепторный комплекс, чтобы, связавшись с ним, включить свой ген. Выше мы говорили, что уже при возникновении компетентности гена он приобретает большую чувствительность к нуклеазам, т. е. структура хроматина изменяется. Молекулярных механизмов этого явления мы не знаем, как не знаем и механизмов компетенции во всех других случаях.

Включение генов, превращение их из компетентных в активно транскрибирующиеся тоже требует определенной специфичности. Таким образом, существенную часть НГБ должны составлять именно такие высокоспецифичные регуляторные белки. Их должно быть много видов – может быть, тысячи. С другой стороны, каждый из них может присутствовать в очень небольшом количестве – может быть, несколько молекул на клетку. У нас пока нет методов, которые могли бы выявить все белки без исключения, и особенно самые малочисленные. Ho с каждым годом техника разделения и выявления белков приближается к этому пределу.

В заключение нам следует упомянуть еще об одной возможности регуляции – посредством не белков, а низкомолекулярных РНК. Исследованы они до сих пор недостаточно – мы знаем только те их виды, которых в клетке много. У РНК, если рассматривать их как кандидатов на роль высокоспецифичных регуляторов, есть важное достоинство. Даже короткая их последовательность, длиной в 20–30 нуклеотидов, может точно опознать тот ген, который имеет участок ДНК, комплементарный к этой РНК. Белок, способный на такое опознавание, должен быть во много раз больше и сложнее. Каким образом низкомолекулярные ядерные РНК осуществляют регуляторную функцию (если они ее осуществляют), совершенно неизвестно. Схемы, которые могут быть предложены, без фактов большой ценности не имеют. Поэтому гипотеза о РНК как о регуляторах генетической активности остается пока не более чем интересной идеей.