Люминесцентный анализ

Краткие теоретические сведения. Люминесцентный анализ основан на зависимости интенсивности люминесценции от концентрации люминесцирующего вещества [1; 2; 12]. Чаще всего в анализе используют один из видов люминесценции – флуоресценцию. Отличительной чертой флуоресценции является ничтожно малый срок жизни излучающих центров (молекул, атомов, ионов) в возбужденном состоянии. Обычно флуоресценцию измеряют, облучая пробу УФ-светом. Другой вид люминесценции – фосфоресценция, в этом случае компоненты пробы продолжают излучать (светиться) и тогда, когда возбуждение пробы прекращают. По спектру испускания люминесценции можно идентифицировать компоненты пробы, а, регистрируя интенсивность флуоресценции или фосфоресценции на определенных длинах волн, определяют очень низкие концентрации этих компонентов.

Для флуоресценции зависимость I_фл= f (C) имеет сложный характер. Величина I_фл определяется, во-первых, интенсивностью поглощенного света I_а, а во-вторых, квантовым выходом флуоресценции j. Оба эти фактора зависят от концентрации флуоресцирующего вещества.

I_фл = I_а (C) j(C).

Величину I_а можно связать с концентрацией, применяя закон Бугера-Ламберта-Бера:

I_а » 2,3 I₀ l e C .

Вывод этой формулы дан в учебниках. Квантовый выход при очень низких концентрациях является константой. В этом случае уравнение градуировочного графика упрощается:

I_фл = КC,

где К»2,3 I₀ e j. График прямолинеен и проходит через начало координат. Для повышения его крутизны (чувствительности определения) можно применять более мощные источники возбуждения (увеличение Iо), работать с большими объемами флуоресцирующего раствора (увеличение l), пользоваться возбуждающим излучением с длиной волны, соответствующей максимуму в спектре поглощения (увеличение e), а также предотвращать посторонние эффекты, снижающие квантовый выход флуоресценции.

Начиная с некоторой концентрации, квантовый выход начинает снижаться:

j = j₀^{-к (с-с0)} .

Это явление (концентрационное тушение) объясняется разными факторами; особенно важно самопоглощение вторичного излучения и безызлучательная разрядка возбужденных частиц при их столкновениях. Оба эти эффекта сильнее выражены в относительно концентрированных растворах. Так как с увеличением С величина I_a возрастает, а j – падает, то результирующая зависимость I_фл от С перестает быть линейной, градуировочный график искривляется, постепенно приближается к горизонтали, а затем, когда влияние j становится преобладающим, на графике появляется ниспадающая ветвь (рис. 13).

Рис. 13. Типичный для флуориметрического анализа градуировочный график (в широком диапазоне концентраций)

Флуориметрическое определение может быть выполнено разными способами: по градуировочному графику, по методу сравнения со стандартным образцом близкого состава, по методу добавок, по методу флуориметрического титрования и т.п. Эти методы аналогичны соответствующим вариантам спектрофотометрического анализа. Важно исключить влияние посторонних веществ на квантовый выход флуоресценции. С этой целью примеси-гасители предварительно отделяют (экстракционная флуориметрия), маскируют или ведут анализ по методу добавок. В последнем случае примеси будут в одинаковой степени гасить флуоресценцию пробы с добавкой известного количества определяемого компонента и без нее.

Предпочтительнее пользоваться не упрощенными флуориметрами с фильтрами, а спектрофлуориметрами с двумя монохроматорами. Возбуждение и регистрация флуоресценции на определенных (оптимальных) длинах волн делает люминесцентный анализ более селективным.

Ярко-зеленое свечение флуоресцеина возбуждается УФ-излучением и коротковолновой частью видимого света. В области микрограммовых и субмикрограммовых концентраций интенсивность флуоресценции растворов этого соединения линейно связана с концентрацией, в миллиграммовой области наблюдается концентрационное тушение. Излучение флуоресцеина зависит от рН раствора: протонированные формы реагента, доминирующие в кислой среде, излучают значительно слабее, чем молекулярные и анионные, которые доминируют в нейтральных и щелочных средах.

Наличие жесткой связи между бензольными кольцами стабилизирует молекулу в возбужденном состоянии вплоть до испускания вторичного кванта, предотвращает безызлучательную разрядку, поэтому флуоресцеин имеет квантовый выход, близкий к единице. Квантовый выход флуоресценции сильно снижается в присутствии ряда посторонних веществ: сильных окислителей и восстановителей, а также ряда d-элементов. Эти эффекты объясняют и протеканием химических реакций, и чисто «физическими» механизмами [19]. Эффект гасящих примесей увеличивается при нарастании их концентрации, однако линейной зависимости не наблюдается. Можно количественно определять гасители по степени уменьшения флуоресценции, однако такие методы малоселективны.