Тонкослойная хроматография

Краткие теоретические сведения. Метод хроматографического разделения компонентов пробы в тонком слое сорбента предложен в 1938г. Измайловым и Шрайбер. В этом методе каплю разделяемой смеси (£ 0,01 мл) наносят на край пластинки, поверхность которой покрыта тонким (до 1 мм) слоем твердого мелкозернистого сорбента. Наиболее часто используют силикагель, оксид алюминия, целлюлозу; в качестве связующего можно добавить гипс, крахмал и т.п. В наиболее распространенном варианте восходящей ТСХ край пластинки помещают в растворитель (подвижная фаза, элюент). За счет капиллярных сил элюент перемещается вверх по слою сорбента, увлекая за собой растворимые компоненты пробы. Скорость их перемещения меньше скорости движения подвижной фазы (ПФ) из-за их взаимодействия с неподвижной фазой (НФ) и определяется индивидуальными свойствами компонентов. Неодинаковая скорость движения компонентов и, следовательно, их разделение в ходе анализа объясняются различием коэффициентов распределения этих компонентов между ПФ и НФ. Обычно компоненты пробы распределяются между органической ПФ и водой, образующей неподвижную жидкую фазу, поскольку каждую частицу сорбента (носителя) покрывает очень тонкий слой воды. Поэтому хроматографическая активность силикагеля или оксида алюминия сильно зависят от их влажности. Однако в ТСХ возможны и другие механизмы распределения компонентов между ПФ и НФ — чисто адсорбционный, ионообменный, молекулярно-ситовый и т.п.

Когда фронт элюента приблизится к верхнему краю пластинки, ее вынимают из хроматографической камеры, высушивают и определяют положение зон компонентов (пятен). Если компоненты пробы не окрашены, хроматограмму проявляют, облучая УФ-светом, обрабатывая парами йода или другими реагентами. При правильном выборе ПФ и НФ, а также при достаточно малом объеме пробы пятна на проявленной хроматограмме не расплываются. Если разделения пробы не произошло, или нет гарантии, что разделились все компоненты пробы, надо повторить все операции с другой ПФ или другим сорбентом. Удобно, в частности, повернуть пластинку на 90⁰ и погрузить ее в новый растворитель. Этот вариант анализа называют двумерной хроматографией (рис. 14).

А б в

ПФ-1 ­ ПФ-2 ®

Рис.14. Двумерная хроматография семикомпонентной смеси
по методу ТСХ:

а – ввод пробы; б – после обработки первым растворителем; в – после обработки вторым растворителем. Указаны стартовые линии и линии подъема фронта растворителя

Для идентификации компонентов пробы пользуются следующими приемами.

1. Сравнение со свидетелем. В этом случае рядом с каплей пробы на стартовую линию наносят капли предполагаемых компонентов пробы (химически чистые индивидуальные вещества или их растворы в ПФ). Совпадение по высоте подъема и окраске пятен после ТСХ указывает на возможное присутствие соответствующего вещества в пробе, хотя и не гарантирует этого (разные вещества могут иметь совпадающие окраски и совпадающие высоты подъема). Для подтверждения эксперимент проводят в новых условиях – с другими сорбентами и другим растворителем. Случайное совпадение характеристик свидетеля и компонента пробы в нескольких системах маловероятно.

2. Сравнение с табличными подвижностями. Отношение высоты подъема данного компонента к высоте подъема фронта растворителя называют подвижностью компонента и обозначают символом R_f . Величина
R_f £ 1, она не зависит от размера пластинки, времени разделения и (при достаточно малой массе пробы) от концентрации компонента в пробе и присутствия других компонентов, то есть это индивидуальная характеристика вещества. Для распространенных систем ПФ – НФ подвижности индивидуальных веществ хорошо известны и собраны в таблицы. Сравнение с табличными значениями R_f – удобный и быстрый метод идентификации, особенно если в лаборатории отсутствует требуемый свидетель или вообще не ясно, какие свидетели можно использовать, поскольку неизвестен даже ориентировочный состав пробы. К сожалению, экспериментальные значения R_f недостаточно хорошо воспроизводимы, поскольку на R_f влияют толщина слоя, влажность и зернистость сорбента, а эти факторы при самостоятельном изготовлении пластинки трудно стандартизировать. Поэтому идентификация по табличным значениям R_f менее надежна, чем идентификация с нанесением реального свидетеля на ту же пластинку.

3. Обработка селективными реагентами. Окраска или свечение соответствующих пятен могут менять при обработке хроматограммы реагентами. Так, некоторые углеводы и аминокислоты имеют совпадающие значения R_f , но при опрыскивании хроматограммы нингидрином пятна аминокислот синеют, а углеводы с этим веществом не реагируют.

4. Спектральная идентификация. Сорбент в соответствующей зоне аккуратно снимают с пластинки и переносят в сосуд, где обрабатывают растворителем. Затем раствор с извлеченным компонентом отфильтровывают и снимают его спектр, например, спектр поглощения в УФ-области против чистого растворителя. По спектру судят о химической природе компонента. В отдельных случаях спектр пятна снимают непосредственно на пластинке (спектр отражения или флуоресценции). Эти же приемы используют и в количественном анализе.